研究背景剩余肝体积不足所导致的肝功能衰竭是肝切除术后致命的并发症。如何有效增加肝切除术后剩余肝脏体积,提高肝切除手术的安全性,一直是肝脏外科致力解决的问题。上世纪80年代,日本的Makuuchi教授首先将选择性门静脉栓塞(portal vein embolization PVE)应用于需要行大范围肝切除术而剩余肝体积又不足的病人。其主要是通过介入方法栓塞门静脉的分支,使栓塞侧肝叶萎缩,而未栓塞侧肝叶代偿性增生,待增生的肝叶体积达到能够满足手术需要时再实施原计划的大范围肝切除手术,从而避免了因剩余肝体积不足而发生术后肝功能衰竭的风险。这项技术的重要意义在于使原本认为因预留肝体积不足无法实施手术的病人重新获得了手术的机会。此后,选择性门静脉栓塞(PVE)或选择性门静脉结扎(portal vein ligation PVL)被越来越多的肝胆外科医生所接受,在世界范围内得到广泛应用。然而,随着临床实施病例数的增加,PVE或PVL的一些不足和弊端也日益受到重视,据文献报道PVE/PVL在2-8周时间诱导预留肝再生率为8%-46%,这说明并非所有病例术后预留肝脏再生程度都能够达到满足手术的需要,而且肝叶增生达到能够满足大范围肝切除手术条件的等待时间亦较长,文献报道平均约36.9天,这为肿瘤的发展、侵袭、转移在时间上提供了条件。此外,众多临床与动物实验报道,实施PVE/PVL后会促使阻塞侧肝叶内肿瘤快速进展。2012年3月,德国Schnitzbauer等介绍了一种新的诱导预留肝脏快速增生的方法。Santibanes和Clavien将此项技术称为“ALPPS"。作者采用选择性门静脉结扎联合原位肝脏实质劈离(portal vein ligation+ in situ splitting PVL+ISS)诱导预留肝叶增生,结果术后平均9天预留肝叶体积增加平均值为74%,随即进行第二次根治性肝切除手术。这是PVE/PVL不可能达到的。这种方法在短时间内显著加速预留肝叶再生,且明显缩短了二次手术等待时间。ALPPS引起了世界肝胆外科界的广泛关注和讨论。但ALPPS的复杂性及术后较高的并发症发生率及死亡率使其应用受到限制,有很多相关问题需要进一步阐明,且门静脉结扎联合原位肝劈离后其加速肝再生的机制还尚不明确,因此,我们认为首先有必要建立-PVL+ISS动物模型,并通过与PVL进行实验对比,从血流动力学、组织病理学和分子生物学等方面揭示其加速肝再生的机制,这也将为进一步研究ALPPS相关问题奠定实验基础。由于联合原位肝劈离能显著加速预留肝脏再生,因此,我们设想在此模型基础上,通过对拟结扎侧肝叶的门静脉支进行限流或同时结扎限流侧肝叶的肝动脉、并联合原位肝劈离诱导预留肝叶增生,观察比较不同手术处理方式术后预留侧肝叶的肝再生率及限流侧肝叶肝组织坏死程度,并评价其潜在的临床应用价值。为解决PVE/PVL术后可能出现的一些相关问题提供新的理论和思路。第一部分选择性门静脉结扎联合原位肝劈离大鼠模型建立目的：建立一成熟稳定的大鼠门静脉结扎联合原位肝劈离模型,为下一步研究ALPPS相关问题奠定实验基础。方法：选取成年健康SD雄性大鼠,体重250-280g。采用乙醚吸入诱导麻醉,麻醉成功后取腹部正中切口进腹,腹壁拉钩将切口牵开并固定,充分暴露手术视野。在手术显微镜下首先进行肝周韧带与肝叶游离,然后按术前制定的计划分别结扎或缝扎大鼠门静脉右叶支、尾叶支、左支(左中叶与左外叶门静脉支),保留大鼠右中叶门静脉支。门静脉左支结扎后会在肝左中叶与右中叶之间出现一明显缺血线,位于镰状韧带稍右侧。沿此缺血线进行原位肝劈离,断面出血采取压迫或缝扎方法止血。腹腔内手术操作结束,查无活动性出血或渗血,关闭腹部切口,术毕。根据对此大鼠模型学习过程中的经验积累、显微手术操作熟练程度、手术成功率等我们将整个学习过程分两个阶段,第Ⅰ阶段15只大鼠,第Ⅱ阶段10只大鼠。通过对两阶段学习的手术操作时间、手术成功率、并发症发生率及术后存活率等方面进行对比,评价模型的稳定性。在术后第10天处死所有存活的大鼠及5只正常大鼠(体重250-280g),电子天平对各大鼠肝右中叶称重评价肝右中叶再生情况。所得实验数据应用统计软件SPSS 18.0进行统计分析,以p<0.05认为有统计学意义。结果：1.两阶段手术时间与手术成功率比较：两阶段手术门静脉结扎时间比较无明显差异。第Ⅱ阶段肝劈离时间与整体手术时间较第Ⅰ阶段明显缩短p<0.05)。第Ⅰ阶段15只大鼠手术过程中6只死亡,手术成功率为60%。第Ⅱ阶段术中操作顺利,手术成功率为100%,比第Ⅰ阶段明显提高p<0.05)。2.两阶段手术并发症发生率与术后存活率比较：在第Ⅰ阶段学习过程中,手术的15只大鼠当中9例出现了并发症。在第Ⅱ阶段手术的10只大鼠中只有1例出现并发症,较第Ⅰ阶段明显降低p<0.05)。经过第Ⅰ阶段的学习训练及经验总结,第Ⅱ阶段10只大鼠术后观察10天存活率为100%,而第Ⅰ阶段15只大鼠除术中死亡6只,剩余9只术后观察10天共死亡3只,术后存活率为66.67%,明显低于第Ⅱ阶段p<0.05)。3.术后第10天处死所有存活的大鼠,电子天平测得肝右中叶由术前正常同体重范围大鼠的2.02±0.23g增加至5.58±0.46g,右中叶再生异常显著。结论：通过两个阶段的摸索与学习,建立动物模型的手术时间与并发症发生率显著降低。第Ⅱ阶段手术成功率与术后存活率达到100%,模型所诱导的术后预留肝脏再生显著,我们首次成功地建立了成熟稳定的大鼠门静脉结扎联合原位肝劈离模型,可以用此模型继续进行下一步相关实验研究。第二部分选择性门静脉结扎联合原位肝劈离术后肝再生率评价及其加速肝再生机制的研究目的：对选择性门静脉结扎联合原位肝劈离大鼠模型术后诱导预留肝脏的肝再生率进行评价,并通过与单纯选择性门静脉结扎相比较,从血流动力学、组织病理学及分子生物学等多方面揭示其加速肝再生的机制。方法：实验动物同第一部分。依据不同手术处理方式将SD大鼠随机分为3组。第1组,假手术组(SHAM)正中口开腹后游离肝周韧带,游离大鼠门静脉、肝动脉、肝胆管各个分支,而后关腹。第2组,选择性门静脉结扎组(PVL)：分离并结扎大鼠门静脉右叶支、尾叶支、左支,保留右中叶支。第3组,选择性门静脉结扎+原位肝劈离组(PVL+ISS):在第2组PVL基础上同时行左中叶与右中叶原位肝劈离。术中应用激光散斑血流成像仪检测原位肝劈离前后肝左、右中叶微循环血流改变。术后选取4个时间点(24h 48h 72h 7d)处死大鼠取标本(血清、肝组织),每组每个时间点6只。用电子天平对各时间点所取肝叶标本分别称重计算肝再生率。检测血清中肝生化指标ALT、AST、ALB和TBIL浓度。HE染色光学显微镜下观察肝左、右中叶组织病理学改变。应用免疫组化方法检测增生肝叶(右中叶)肝细胞增殖指标Ki-67的表达情况。以RT-PCR和ELISA方法检测增生肝叶内或血清中细胞因子TNF-a、IL-6、HGF、HSP70的表达情况。实验数据统计处理同第一部分。结果：1.术后肝再生率PVL组与PVL+ISS组在各时间点均显著高于假手术组(p<0.05)。在术后72h与7d, PVL+ISS组的肝再生率明显高于PVL组(p<0.05),在术后24h与48h两组的肝再生率无明显差异(p>0.05)。2.术中激光散斑检测微循环血流改变显示：选择性门静脉结扎后,肝右中叶微循环血流明显增加而左中叶明显减少(p<0.05)。实施肝劈离后,肝右中叶微循环血流无明显增加(p>0.05),而左中叶微循环血流进一步减少(p<0.05)。3.血液肝生化指标检测：在术后24h、48h, PVL组与PVL+ISS组血ALT与AST水平均较假手术组高。术后24h, PVL+ISS组血ALT与AST水平较PVL组高p<0.05),术后48h无明显差别。血ALB水平两实验组在各时间点均较假手术组低p<0.05),PVL+ISS组在术后24h、48h、72h较PVL组低(p<0.05)。血TBIL水平各组各时间点均未见明显差别(p>0.05)。4.组织病理学检测：术后24h肝左中叶HE染色显示肝坏死面积PVL+ISS组较PVL组大(p<0.05)。肝右中叶Ki-67免疫组化染色结果显示：术后24h、7d两实验组无明显差异(p>0.05),而术后48h、72h,PVL+ISS组Ki-67阳性肝细胞数明显较PVL组高p<0.05)。5.术后24h增生肝叶内与血清中细胞因子检测：两实验组各细胞因子TNF-a、 IL-6、HGF、HSP70 mRNA水平均表现为上调,TNF-a、IL-6 mRNA表达水平PVL+ISS组较PVL组高p<0.05),HGF、HSP70 mRNA水平两组无明显差异(p>0.05)。 ELISA检测肝匀浆液结果表明TNF-a、IL-6、HGF蛋白水平两实验组均表现为升高,但PVL+ISS组较PVL组升高更为明显(p<0.05)。PVL+ISS组与PVL组血清TNF-a、IL-6均较SHAM组高(p<0.05), PVL+ISS组高于PVL组(p<0.05)。两实验组血清HGF水平未见明显差异,但均高于SHAM组p<0.05)。结论：1.同假手术组比较,PVL与PVL+ISS都能够有效诱导预留肝脏再生,但PVL+ISS术后肝再生率升高更为显著。这也进一步证实了大鼠PVL+ISS模型的确切性。2. PVL+ISS加速预留肝脏再生与原位肝劈离引起的肝左中叶(结扎侧肝叶)微循环血流进一步减少及血液和增生肝叶中与肝细胞增殖密切相关的细胞因子尤其是TNF-α和IL-6的表达上调有关。3.血液肝生化指标检测：在术后24h、48h, PVL组与PVL+ISS组血ALT与AST水平均较假手术组高。术后24h, PVL+ISS组血ALT与AST水平较PVL组高p<0.05),术后48h无明显差别。血ALB水平两实验组在各时间点均较假手术组低p<0.05),PVL+ISS组在术后24h、48h、72h较PVL组低(p<0.05)。血TBIL水平各组各时间点均未见明显差别(p>0.05)。4.组织病理学检测：术后24h肝左中叶HE染色显示肝坏死面积PVL+ISS组较PVL组大(p<0.05)。肝右中叶Ki-67免疫组化染色结果显示：术后24h、7d两实验组无明显差异(p>0.05),而术后48h、72h,PVL+ISS组Ki-67阳性肝细胞数明显较PVL组高p<0.05)。5.术后24h增生肝叶内与血清中细胞因子检测：两实验组各细胞因子TNF-a、 IL-6、HGF、HSP70 mRNA水平均表现为上调,TNF-a、IL-6 mRNA表达水平PVL+ISS组较PVL组高p<0.05),HGF、HSP70 mRNA水平两组无明显差异(p>0.05)。 ELISA检测肝匀浆液结果表明TNF-a、IL-6、HGF蛋白水平两实验组均表现为升高,但PVL+ISS组较PVL组升高更为明显(p<0.05)。PVL+ISS组与PVL组血清TNF-a、IL-6均较SHAM组高(p<0.05), PVL+ISS组高于PVL组(p<0.05)。两实验组血清HGF水平未见明显差异,但均高于SHAM组p<0.05)。结论：1.同假手术组比较,PVL与PVL+ISS都能够有效诱导预留肝脏再生,但PVL+ISS术后肝再生率升高更为显著。这也进一步证实了大鼠PVL+ISS模型的确切性。2. PVL+ISS加速预留肝脏再生与原位肝劈离引起的肝左中叶(结扎侧肝叶)微循环血流进一步减少及血液和增生肝叶中与肝细胞增殖密切相关的细胞因子尤其是TNF-α和IL-6的表达上调有关。第三部分 选择性门静脉限流或同时行肝动脉结扎联合原位肝劈离对肝再生与肝损伤的影响及临床意义目的：通过对大鼠进行选择性门静脉限流联合原位肝劈离或选择性门静脉限流同时行肝动脉结扎并联合原位肝劈离,以PVL作为对照,对比两种不同手术处理方式对预留肝脏再生和限流侧肝脏损伤的影响,评价其诱导预留肝脏再生的意义和潜在的临床应用价值。方法：一、首先对门静脉左支不同程度限流或同时行肝动脉结扎联合原位肝劈离对预留肝脏再生及阻塞侧肝脏损伤的影响进行初步评价。限流方法采用不同粗细针头与门静脉左支丝线结扎,而后将针头抽出造成门静脉不同程度狭窄,进而不同程度的限制门静脉血流。根据手术处置方式不同设立四个实验组：(1)选择性门静脉限流组(PPVL):结扎大鼠门静脉尾叶支、右叶支、对门静脉左支进行限流。(2)选择性门静脉限流联合原位肝劈离组(PPVL+ISS):即在上述选择性门静脉限流基础上联合原位肝劈离。(3)选择性门静脉限流+肝动脉结扎组(PPVAL):按上述(1)中进行选择性门静脉限流后,双重结扎与门静脉左支伴行的供应限流侧肝叶(肝左中叶与左外叶)的动脉干,而后在两结扎线之间将肝动脉干切断。(4)选择性门静脉限流+肝动脉结扎并联合原位肝劈离组(PPVAL+ISS):在上述(3)的基础上联合原位肝劈离。每一实验组再根据门静脉限流程度不同(直径0.6mm 0.5mm 0.4mmm 0.25mm针头,之前测得门静脉左支直径平均值为1.28±0.05mm)各分为四个亚组。每个实验组16只大鼠,每个亚组4只大鼠。术后72h处死大鼠,对各组大鼠术后右中叶肝再生率与左中叶肝坏死面积进行初步评价。二、根据上面实验的初步评价结果,我们选取用0.4mm针头限流的两实验组PPVL+ISS组(0.4mm限流)与PPVAL+ISS组(0.4mm限流)做进一步实验研究,并以第一部分PVL组作为对照组。各组手术操作方法同前。术后仍选取4个时间点(24h、48h、72h、7d)处死大鼠取标本,每组每个时间点6只大鼠。术中用超声波血流测量仪与激光散斑仪分别检测门静脉左支限流前后及离断肝动脉后的血流改变与肝左右中叶微循环血流变化。术后按前述方法计算各组各时间点肝再生率。检测血清中肝生化指标ALT、AST、ALB、TBIL浓度。HE染色光学显微镜下观察肝左中叶组织病理学改变。免疫组化方法检测增生肝叶肝细胞增殖指标Ki-67的表达情况。以RT-PCR方法检测术后24h增生肝叶内细胞因子TNF-a、IL-6、HGF、HSP70 mRNA的表达情况。实验数据统计处理同第一部分。结果：一、门静脉左支不同程度限流或同时行肝动脉结扎联合原位肝劈离对肝再生与肝损伤的初步评价结果：1.组内比较：除PPVAL与PPVAL+ISS组内0.4mm和0.25mm针头限流时肝再生率(HRR)无明显差异外,各组内肝右中叶HRR均随门静脉限流程度增强而逐步升高p<0.05),肝左中叶肝坏死面积随门静脉限流程度增强而逐渐增大p<0.05)。2.组间比较：0.6mm与0.5mm直径针头限流时,PPVAL与PPVAL+ISS组的HRR均较PPVL、PPVL+ISS组高p<0.05),PPVAL与PPVAL+ISS、PPVL与PPVL+ISS之间HRR均无差异。0.6mm针头限流时各组肝左中叶HE染色均未见肝组织坏死。0.5mm针头限流在PPVAL与PPVAL+ISS组出现轻度坏死。直径0.4mm针头限流时,PPVAL+ISS组HRR较其余三组显著升高p<0.05),PPVAL与PPVL+ISS组未见差异但均高于PPVL组。PPVAL与PPVAL+ISS组肝左中叶坏死面积分数高于PPVL与PPVL+ISS组p<0.05),PPVAL+ISS较PPVAL组高p<0.05),但PPVL与PPVL+ISS组之间无差异。直径0.25mm针头限流时,PPVAL+ISS组有两只大鼠术后死亡,PPVL+ISS与PPVAL+ISS组HRR显著高于PPVL与PPVAL组(p<0.05),PPVL+ISS与PPVAL+ISS组及PPVL与PPVAL组之间无差异。PPVAL与PPVAL+ISS组肝左叶肉眼见大面积坏死,光镜下观察PPVL+ISS组肝坏死面积总分数高于PPVL组p<0.05)。二、门静脉左支0.4mmm针头限流时PPVL+ISS、PPVAL+ISS与PVL相互对比实验结果：1.门静脉左支进行0.4mm针头限流前血流量为6.35±0.50m1/min,限流后减少为1.85-±0.32m1/min,结扎伴行肝动脉后血流量为1.88±0.33m1/min,与动脉结扎前无显著变化p>0.05)。2.门静脉左支限流后,激光散斑测右中叶微循环血流较限流前增高(p<0.05),左中叶较限流前减少p<0.05)。将伴行肝动脉结扎后,右中叶微循环血流同动脉结扎前无明显变化,左中叶则较动脉结扎前均显著减少(p<0.05)。3.术后24h各组HRR未见差异(p>0.05)。术后48h、72h、7d, PPVAL+ISS组HRR均显著高于PPVL+ISS组与PVL组(p<0.05)。 PPVL+ISS组与PVL组HRR各时间点比较无统计学差异(p>0.05)。4.各组增生肝叶中Ki-67表达在术后24h、7d无明显差别。术后48h、72h,PPVAL+ISS组Ki-67表达强度高于PPVL+ISS组与PVL组(p<0.05)。PPVL+ISS与PVL组术后48h未见差异,术后72h, PPVL+ISS组低于PVL组p<0.05)。5.术后24h肝左中叶坏死面积总分数PPVAL+ISS组明显高于PVL组与PPVL+ISS组(p<0.05)。而PPVL+ISS组明显低于其他两组(p<0.05)。6.术后24、48h, PPVAL+ISS组血ALT、AST水平明显高于PPVL+ISS组与PVL组(p<0.05),ALT水平PPVL+ISS组较PVL组低(p<0.05)。AST水平PPVL+ISS组术后48h较PVL组低(p<0.05)。PPVAL+ISS组血ALB水平在术后24、48h低于PVL组和PPVL+ISS组(p<0.05)。PVL组术后48h血ALB低于PPVL+ISS组(p<0.05),血TBIL水平在术后24h、48h,PPVAL+ISS组显著高于其它两组(p<0.05)。术后72h、7d各组各指标均无差异(p>0.05)。7.增生肝叶中PPVAL+ISS组和PPVL+ISS组TNF-α、IL-6 mRNA水平与PVL组比较均表现为上调(p<0.05), PPVAL+ISS组上调水平高于PPVL+ISS组(p<0.05)。HGF mRNA表达水平PPVAL+ISS组高于其他两组(p<0.05), HSP70 mRNA水平三组之间无明显差异(p>0.05)。结论：1.选择性门静脉限流时,联合肝动脉结扎或原位肝劈离均有利于肝脏再生,肝再生率随门静脉限流程度增强而呈升高趋势,但联合原位肝劈离只有在门静脉限流达到一定强度时其对肝再生才起促进作用。2.联合肝动脉结扎对限流侧肝叶损伤加重,此时必须掌握好门静脉的限流程度,避免限流侧肝叶大面积肝坏死或形成肝脓肿。3.用0.4mmm直径针头限流时,PPVL+ISS术后肝再生率与PVL相当,限流侧肝叶损伤较PVL轻。PPVAL+ISS术后肝再生率较PVL显著升高,限流侧肝叶坏死面积增大,但未出现大面积肝坏死,因此是安全可行的。4.只要掌握好门静脉限流程度,PPVL+ISS与PPVAL+ISS诱导预留肝脏再生都是安全有效可行的方法。PPVL+ISS对一些术前肝功能稍差或患病侧肝动脉受病变侵犯而狭窄甚至闭塞的患者可能有一定的临床应用价值。而PPVAL+ISS在诱导肝再生过程中因完全阻断了限流侧肝叶的动脉血流理论上可能使其内肿瘤因失去血供而发生萎缩或坏死,为解决PVE/PVL后阻塞侧肝叶内肿瘤快速进展问题提供新的思路。