论文部分内容阅读
目的：生物体的睡眠/觉醒、进食等行为以及各种生理、生化、代谢过程遵循着大约24小时的周期性变化,称为昼夜节律(circadian rhythms),其广泛存在于光敏感的生物中。从调节低等生物,如蓝藻的光合作用,到影响哺乳动物的进食行为,昼夜节律与能量代谢之间存在着紧密的联系。机体能量代谢如何调节昼夜节律系统的分子机制至今并不明确,我们的研究旨在探讨蛋白质氧连p-N-乙酰葡糖胺修饰(O-linked β-N-acetlgluosamine, O-GlcNAcylation)是否在调节机体昼夜节律系统中发挥作用,从而为阐明能量代谢如何调节昼夜节律提供新的线索。方法：哺乳动物昼夜节律系统的分子模型是以转录因子CLOCK、 BMAL1所组成的异源二聚体为核心的转录、翻译反馈环路。利用实时昼夜节律性光度分析技术,我们在体外N1H3T3细胞中检测蛋白质O-G1cNAc修饰抑制剂DON对于细胞内节律基因表达的影响。琥珀酰麦胚凝集素(sWGA)可以特异性富集被O-G1cNAc修饰的蛋白,在sWGA富集NIH3T3内源性蛋白时,我们利用不同节律蛋白抗体检测哪些节律蛋白可以被富集。同时,利用特异性识别糖基化蛋白的抗体CTD110.6检测免疫沉淀得到的节律蛋白是否能够被O-G1cNAc修饰。利用免疫共沉淀和GST pull down技术检测节律蛋白与催化蛋白质糖基化的酶OGT之间是否存在相互作用。利用放线菌酮抑制细胞内新蛋白合成,检测细胞内节律蛋白在O-G1cNAc修饰被抑制时,稳定性是否改变。利用荧光素酶报告系统检测O-G1cNAc修饰减弱时,CLOCK/BMAL1异源二聚体转录活性是否改变；实时荧光定量PCR检测此时其下游节律基因的表达。结果：1.DON处理细胞后,实时昼夜节律性光度测定发现节律基因的表达明显降低,细胞节律衰减加快；2. sWGA特异性富集到核心节律蛋白BMAL1;免疫沉淀得到的BMAL1蛋白节律性地被O-G1cNAc修饰,其修饰程度随着OGA过表达降低,OGT过表达增高；3.免疫共沉淀及GST pull down实验检测到BMAL1与OGT之间存在相互作用；4.DON处理细胞或过表达OGA时,BMAL1蛋白稳定性降低；5.DON处理细胞或过表达OGA时,CLOCK/BMAL1蛋白转录活性降低,下游基因表达减弱。结论：1.核心节律蛋白BMAL1可以被O-G1cNAc修饰并具有节律性；2. O-G1cNAc修饰增强了BMAL1蛋白稳定性；3.O-G1cNAc修饰减弱时,CLOCK/BMAL1蛋白转录活性降低,下游基因表达减弱。我们的研究发现,BMAL1蛋白的O-G1cNAc修饰可能是一种新的机体能量代谢调节昼夜节律的重要方式,为阐明能量代谢与昼夜节律之间的复杂关系提供了新的线索。