土壤单一/复合污染物暴露毒性响应及生物标记物分析方法的建立

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本文探讨了赤子爱胜蚯蚓在污染物长期暴露下,其体内酶性生物标记物(细胞色素P450含量,超氧化物歧化酶(SOD),过氧化氢酶(CAT)及谷胱甘肽转移酶(GST)活力)的响应规律,建立了利用液相串联质谱联用仪(LC-MS/MS)测定蚯蚓体内CYP2C9活力的方法,研究了细胞代谢组学的核磁共振波谱测定方法及丰成分分析处理数据的方法。   暴露于低剂量镉(Cd)(1.25,2.50,5.00与10.00 mg/kg)土壤8周时间内,前4周蚯蚓体内的镉积累速度较快,而在后4周增长幅度较小。CYP含量在暴露2到4周时表现出显著的增加,而暴露6-8周时则显现出显著的降低。SOD及CAT活力在此实验中表现出相似的变化趋势,GST活力从暴露四周起表现出显著增加。   暴露于铜污染(100,200,300与400mg/kg)土壤中8周后,对蚯蚓的毒害作用表现为先诱导后抑制的模式。P450在暴露2周后表现出显著诱导;GST与SOD,CAT则均在第3周开始表现出显著诱导。暴露时间大于4周时,P450及GST开始表现抑制作用,SOD及CAT则在暴露大于6周后显现抑制作用。   相比抗氧化酶或谷胱甘肽转移酶,CYP含量是对污染最为敏感的。相比于暴露浓度,暴露时间在生物标记物的响应过程中发挥更重要的作用。   镉与芘的复合污染物(镉2.50 mg/kg+芘0.96 mg/kg)引起的分子生物标记物响应不同于单一污染物引起的响应。混合污染物对生物标记物的相互作用随着暴露时间的变化而变化:暴露初期对CYP含量,SOD及GST活力表现出拮抗作用;但实验结束时,混合污染物暴露使CYP含量及GST降低的幅度减少,使SOD及CAT活力的增幅提高,表现为加和作用。由于镉的存在,低剂量芘的毒性被延长。   本论文建立了利用LC-MS/MS测定蚯蚓体内CYP2C9活力的方法,该方法采用正离子电离,多元反应监测模式,方法的精确度,准确度,稳定性及回收率完全符合美国健康与食品药品署的规定,并表现出了巨大的优势,如更低的定量下限,样品的测定时间短。利用上述验证方法测定蚯蚓体内的CYP2C9活力,必须保证微粒体蛋白量在10-100μgml-1,孵育时间15min。   此外,本论文确定了提取细胞内代谢物的最佳方法方法为冷甲醇法,确定了利用核磁共振波谱仪(NMR)测定细胞内代谢物样品的最小细胞数目为2.28e+06,确定了NOESY为NMR测定样品的最佳脉冲程序及利用Unscrambler软件多元分析NMR波谱的标准数据处理程序。通过过氧化氢暴露实验,表明受试浓度的过氧化氢已能引起细胞内的代谢物发生明显变化。  
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