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骨髓间充质干细胞(BMMSCs)是干细胞与组织工程领域新的研究热点,BMMSCs是一种可以多向分化的成体干细胞,具有取材方便,易分离培养,增殖能力强,来源于自体无排斥反应的特点。近年来,尽管已成功应用自体成熟细胞如成纤维细胞来修复皮肤缺损,但BMMSCs与这些分化的细胞相比具有更大的优势。因为BMMSCs是中胚层来源的干细胞,在体外培养的过程中,BMMSCs可以保持未分化表型不断增殖,达到所需数量,再经诱导可分化为所需表型;另外,BMMSCs易于从骨髓中分离获得,避免了通过手术从患者自身获取成熟细胞所造成的二次损伤。本研究在实验室成功培养了组织工程皮肤的种子细胞:角朊细胞,成纤维细胞和骨髓间充质干细胞;建立皮肤损伤动物模型:直接切除模型和烧伤模型;用构建的组织工程全层皮肤和含BMMSCs的组织工程真皮修复损伤模型,观察修复效果,为构建具有生理功能的组织工程皮肤奠定基础。第一部分:种子细胞的培养以免疫原性较低的新生猪背部皮肤为取材对象,Dispase酶消化过夜仔细分离表皮层和真皮层,表皮层用胰酶消化后得到的细胞用角朊细胞培养基(K-SFM)培养;真皮层剪碎用胶原酶消化后得到的成纤维细胞用4种不同培养基培养,MTT和BrdU检测活力。角朊细胞和成纤维细胞在体外生长状态良好,增殖快,呈典型的铺路石样和长梭形。从猪髂骨处抽取骨髓,本实验采用Percoll密度梯度离心法与贴壁筛选法相结合分离纯化BMMSCs,多次传代后的BMMSCs为形态均一、排列有序的成纤维细胞样,提示传代过程对纯化骨髓单个核细胞中的BMMSCs有一定作用。猪BMMSCs在体外条件下生长稳定,传代后仍保持良好的状态,有分化的潜能,可作为组织工程皮肤的种子细胞。第二部分:组织工程皮肤的研制将成纤维细胞种植入Ⅰ型胶原凝胶中,培养3 d后,将表皮细胞接种在凝胶的表面,继续培养2 d ,然后将凝胶移至气液面进行复层化3 d。结果发现所培养的人工皮肤具备表皮层和真皮层,其结构和正常皮肤的结构相似。证明了以新生猪皮肤为细胞来源、Ⅰ型胶原为支架构建的全层组织工程皮肤,在组织学上与皮肤组织结构相类似,可以作为皮肤替代物。体外培养并扩增猪BMMSCs,用PKH26荧光染色试剂盒进行荧光标记,将标记好的细胞种植入Ⅰ型胶原凝胶中,培养3 d后后将凝胶移至气液面继续培养2 d。光镜下可见与正常皮肤的真皮部分相似,表皮层缺如,真皮层较厚,但组织工程皮肤中缺少毛囊、汗腺和血管结构等。荧光显微镜观察可见,在真皮层中富含PKH26标记的细胞(胞膜呈红色荧光)。第三部分:组织工程皮肤修复动物皮肤缺损的实验研究用构建的组织工程全层皮肤和含BMMSCs的组织工程真皮修复动物的急性切除模型,观察创面愈合情况。TE全层组和BMMSCs组在皮片成活率和创面收缩率上无明显差异,HE、Masson、网状纤维和PAS染色观察组织学变化,发现BMMSCs组具有良好的组织相容性和生物学活性,与受者愈合良好,未见显著的免疫排斥反应。用实验室自行研制的烫伤仪,根据调整烫头和皮肤接触的时间和温度,调节烫伤仪至:温度100℃,时间20 s,模拟深Ⅱ度烫伤模型。用组织工程全层皮肤和复合BMMSCs(PKH26标记)的组织工程真皮修复烫伤创面,移植2 wk后实验组创面基本愈合,TE全层组和BMMSCs组的愈合时间、效果没有差异。BMMSCs组真皮层毛细血管增生,6 wk时仍可检测到红色荧光标记的骨髓间充质细胞,免疫组织化学染色显示角蛋白和Ⅰ型胶原表达阳性。含有BMMSCs的组织工程皮肤移植后促进了烫伤创面愈合,获得了较理想的愈合效果,为临床治疗提供了新的思路。