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猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS),俗称猪蓝耳病,是一种高度接触性传染病。该病具有高发病率、高致死率和持续性感染的特点,是危害世界养猪业头号疫病之一。造成PRRS持续性感染的因素很多,其中一个重要原因是其病原PRRSV(PRRS virus)进化出多种策略拮抗宿主细胞天然免疫应答,包括抑制I型干扰素(type I interferons,type I IFNs)表达和推迟高水平促炎细胞因子诱导产生等。DNAX激活蛋白12(DNAX-activating protein of 12 kDa,DAP12)是免疫细胞中重要接头蛋白。DAP12通常被相关受体募集活化,进而招募并激活下游分子,从而介导不同的免疫学功能。本课题主要围绕“DAP12在PRRSV调节宿主细胞抗病毒天然免疫应答的作用机制”开展研究。研究内容主要分为以下三方面:第一部分DAP12在PRRSV调节宿主细胞天然免疫应答中的功能本章节研究中,首先在猪肺泡巨噬细胞(PAMs)中敲低DAP12,发现能增强PRRSV诱导I型干扰素和促炎细胞因子转录,干扰素调控因子-3(IFN regulatory factor 3,IRF-3)磷酸化水平也明显提高;在CRL-2843-CD163细胞中过表达DAP12则会抑制上述细胞因子转录活化。进一步探索PRRSV是否利用DAP12-脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase,Syk)信号通路抑制宿主细胞抗病毒促炎细胞应答,发现PRRSV感染增强DAP12-Syk通路活化(包括二者磷酸化及相互作用),敲低Syk或抑制Syk活性会增加PRRSV激发促炎细胞因子的产生。接下来,研究了PRRSV感染中,DAP12-Syk通路对炎症通路活化的影响。结果表明,在PAMs中敲低DAP12能增强PRRSV诱导ERK1/2、p38、NF-κB的活化;在CRL-2843-CD163细胞中,过表达DAP12能抑制PRRSV激活的NF-κB通路(MAPKs通路的活化不受影响)。而在敲低Syk的细胞中,DAP12过表达不能发挥抑制功能。上述结果表明,PRRSV能够利用DAP12拮抗IRF-3介导的IFNs应答以及NF-κB介导的促炎细胞应答。这些发现有助于加深对PRRSV致病机制的了解。第二部分NMHC-IIA-DAP12在PRRSV抑制宿主细胞抗病毒炎症应答的作用机制研究非肌肉肌球重链蛋白IIA(non-muscle myosin heavy chain IIA,NMHC-IIA)是非肌肉肌球蛋白IIA(non-muscle myosin IIA,NM-IIA)亚基,参与细胞迁移、形态维持以及信号转导等众多重要生理学过程。此前研究表明NMHC-IIA可以参与PRRSV对细胞入侵。本章节首先通过免疫沉淀(immunoprecipitation,IP)及质谱(mass spectrometry,MS)分析鉴定出NMHC-IIA是PRRSV感染早期DAP12显著结合蛋白。随后通过Co-IP和激光共聚焦显微术确定了PRRSV感染促进NMHC-IIA-DAP12-Syk三元复合物的形成。根据DAP12免疫接头蛋白的特性,NMHC-IIA可能作为受体通过偶联DAP12发挥免疫调节功能,因此下一步确定NMHC-IIA在PRRSV感染早期的作用及其作用机制。进一步利用pulldown证实,NMHC-IIA和DAP12互作依赖于NMHC-IIA羧基端非螺旋区和DAP12跨膜区50-57位氨基酸的结合。随后发现,NMHC-IIA通过识别PRRSV糖蛋白5(glycoprotein 5,GP5)表面唾液酸修饰活化DAP12-Syk通路,抑制NF-κB/MAPKs通路介导的促炎细胞应答。利用另一种唾液酸修饰RNA病毒-水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)证实该病毒可以被NMHC-IIA识别,从而激活DAP12-Syk通路抑制宿主细胞促炎细胞应答的发生。以上结果揭示出唾液酸化修饰RNA病毒利用NMHC-IIA-DAP12-Syk通路拮抗宿主抗病毒免疫反应的新策略。更重要的是,唾液酸类似物同样可以激活该通路抑制脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激下NF-κB介导的炎症应答。NMHC-IIA对炎症应答的负调控可能是免疫细胞中普遍存在的调节机制,是机体维持稳态的重要手段之一,也可能是新的潜在抗炎药物靶点。第三部分poSn-DAP12在PRRSV抑制宿主细胞I型干扰素应答中的作用机制研究猪唾液酸黏附素(porcine sialoadhesin,poSn)也被称为唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-1(sialic-acid-binding immunoglobulin-like lectin-1,Siglec-1),曾被认为是PRRSV入侵宿主细胞的关键受体之一。最近有报道称poSn基因敲除猪对PRRSV仍易感,提示poSn可能在PRRSV感染中发挥其他作用。本章节研究发现,PRRSV感染晚期通过IFN-信号转导子和转录激活子1(signal transducer and activator of transcription 1,STAT1)通路诱导poSn上调。poSn随后抑制PRRSV感染中I型干扰素的产生。进一步研究表明,PRRSV感染能增强poSn和DAP12的相互作用,poSn-DAP12通路参与拮抗NF-κB和IRF-3介导的IFNs应答。本研究从一个全新的角度重新解释了poSn在PRRSV感染中的作用。综上所述,PRRSV感染中DAP12作为重要的免疫接头蛋白,偶联不同的受体蛋白,参与对宿主细胞抗病毒天然免疫应答的抑制。其中,在PRRSV感染早期,NMHCIIA通过识别病毒表面唾液酸修饰,募集并活化DAP12-Syk通路,抑制抗病毒炎症反应;在PRRSV感染晚期,poSn通过偶联DAP12参与拮抗抗病毒干扰素应答。此外,NMHC-IIA-DAP12-Syk通路抑制LPS激活的促炎细胞应答;poSn-DAP12通路抑制poly(I:C)诱导的I型干扰素的产生。这些发现扩展了对宿主细胞天然免疫应答负调控机制的理解,为PRRSV及其它唾液酸化RNA病毒的防控提供新的理论依据。