急性肾功能衰竭(acute renal failure，ARF)是继发于休克、创伤、严重感染、溶血等病因的急性肾实质损害的总称，也是肝移植术后常见及严重的并发症。随着手术技术及围术期处理水平的进步，肝移植手术日益成熟，研究重点已从手术技巧转向并发症的防治，ARF作为常见和致命性的并发症，是导致肝移植术后早期死亡的重要原因。有报道，肝移植术后早期ARF的发生率为8.3％—87.0％，术后合并ARF的患者的病死率可高达23.0％—46.67％。 国内外文献报道，术前内毒素、高胆红素血症、缺血/再灌注损伤等因素在肝移植早期ARF发生中起着重要作用。内毒素(lipopolysaccharide，LPS)可通过不同途径引起血小板黏附、聚集，并激活内、外源性凝血系统，导致弥漫性血管内凝血，在肾、肝、肺和心肌等组织微血管中形成广泛性微血栓，研究显示内毒素能直接引起肾小管损害，许多研究显示肝功能衰竭患者血浆内毒素明显增高。高胆红素血症是肝移植围术期至术后早期的重要特征之一，胆红素(bilirubin，BR)作为一种具有潜在毒性的血红素终末代谢产物，研究提示直接胆红素能增加肾脏对缺血损害的敏感性，是造成肾损害的重要因素之一。 急性肾功能衰竭的机理十分复杂。ARF的本质是肾细胞(肾小管细胞、内皮细胞和系膜细胞)的损害。20世纪40年代就已证明肾小管细胞损伤是ARF的主要病理过程，细胞受损而出现的代谢、功能以及形态结构的紊乱是肾小球滤过率下降和肾脏排泌功能失调的重要病理生理基础。 肾小管上皮细胞之间存在着广泛的缝隙连接(gap junction，GJ)通路。GJ是细胞间的直接信息交换通道，内环境稳定的维持需要细胞间缝隙连接的参与，许多病理状态均会引起GJ的改变。GJ在维持组织内环境稳定、增强组织对激素的反应、调节组织细胞的生长发育、控制细胞增殖等方面起重要作用。研究发现，很多疾病或机体的病理生理状态可能与GJ的蛋白表达异常有关。 本研究将通过探讨不同浓度的LPS和BR单独及联合作用时体外培养肾小管上皮细胞的生长活性、细胞增殖能力、细胞间GJ功能及细胞超微结构的改变，以及缝隙连接阻断剂(TPA)及促进剂(RA)对LPS和BR作用的影响，明确GJ功能变化在肾小管损伤中的地位。 方法： 1.将体外培养的大鼠肾小管上皮细胞(NRK52E cells)作为研究对象，实验共分为3部分： (1)内毒素组：control组、LPS10ng/ml、LPS50ng/ml、LPS100ng/ml、LPS500ng/ml、LPS1000ng/ml共6个亚组； TPA和RA干预组：TPA组、RA组、RA+LPS100ng/ml、RA+LPS1000ng/ml共4个亚组。 (2)胆红素组：control组、BR17.1umol、BR85.5 umol、BR171 umol、BR342 umol、BR513 umol、BR684 umol、BR855 umol、BR1026 umol共9个亚组； TPA和RA干预组：TPA组、RA组、TPA+BR513 umol、RA+BR1026 umol共4个亚组。 (3)内毒素十胆红素组：LPS1000ng/ml、BR513 umol、BR1026 umol、LPS1000ng/ml+BR513 umol、LPS1000ng/ml+BR1026 umol共5个亚组。 2.检测方法 (1)采用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)检测NRK52E细胞的生长活性。观察LPS和BR对NRK52E细胞生长活性及作用，并用TPA和RA进行干预。 (2)采用标准细胞集落形成分析法(Standard colony—forming assay，SCFA)检测NRK52E细胞的增殖能力。 (3)采用细胞荧光免疫示踪法(Parachute Assay)测定NRK52E细胞间GJ的功能。 (4)透射电子显微镜观察NRK52E细胞的细胞超微结构的影响。 结果： 1.(1)、随着LPS浓度的增加NRK52E细胞生长活性逐渐降低，与LPS10ng/ml相比，LPS50ng/ml至1000ng/ml组差异显著(P<0.01)，1000ng/ml时细胞生存率达到最低(P<0.01)。(2)、随着LPS浓度的增加NRK52E细胞集落形成率逐渐降低，与LPS10ng/ml相比，LPS50ng/ml至1000ng/ml各组均有差异，LPS1000ng/ml时集落形成率最低(P<0.01)；LPS100ng/ml、LPS500ng/ml及LPS1000ng/ml时高、低密度细胞集落形成率相比均有显著差异(P<0.01)。RA可以增加LPS在低密度细胞时的集落形成率(P<0.01)。(3)、随着LPS浓度的增加NRK52E细胞间GJ传递功能逐渐降低，与对照组相比，LPS100ng/ml至1000ng/ml之间均有显著差异(P<0.01)。RA可以减弱LPS1000ng/ml对细胞GJ的抑制作用(P<0.05)。(4)、透射电镜观察，对照组细胞超微结构无明显改变；LPS1000ng/ml时NRK52E细胞超微结构损伤显著。 2.(1)、BR对NRK52E细胞生长活性的作用表现为：从17.1umol至513umol，NRK52E细胞活性逐渐增强，与BR17.1umol相比，BR85.5umol至513umol组间差异显著，513umol时细胞生长活性最强(P<0.05)，TPA可以降低BR513umol时细胞的生长活性(P<0.05)；从513umol至1026umol，NRK52E细胞活性逐渐减弱，与BR513umol相比，684umol至1026umol组间差异明显，1026umol时细胞活性最低(P<0.05)，RA对BR1026umol无作用(P>0.05)。(2)、BR对NRK52E细胞集落形成率的作用表现为：从17.1umol至513umol，NRK52E细胞增殖能力逐渐增强，与BR17.1umol相比，BR85.5umol至513umol各组差异显著，513umol时细胞增殖能力最强(P<0.05)；从513umol至1026umol，NRK52E细胞增殖能力逐渐减弱，与BR513umol相比，684umol至1026umol各组差异明显，1026umol时细胞增殖能力最低(P<0.05)。TPA可以降低BR513umol时细胞集落形成率(P<0.05)；RA对BR1026umol无作用(P>0.05)，各浓度组高密度和低密度细胞集落形成率相比均有差异(P<0.05或P<0.01)。(3)、BR对细胞间GJ传递功能的作用表现为：从17.1umol至513umol，NRK52E细胞间GJ传递功能逐渐增强，从513umol至1026umol，NRK52E细胞间GJ传递功能逐渐减弱，与对照组相比，BR85.5umol至1026umol各组差异显著，513umol时细胞间GJ传递功能最强(P<0.05)，1026umol时细胞间GJ传递功能最低(P<0.05)。TPA可以BR513umol对细胞间GJ的促进作用(P<0.05)。(4)、电镜观察显示，对照组和BR513umolNRK52E细胞超微结构无明显损伤性改变；BR1026umol时NRK52E细胞超微结构损伤显著。 3.与LPS1000ng/ml相比，BR513muol+LPS1000ng/ml对NRK52E细胞的生长活性、细胞的集落形成率、细胞间GJ传递功能及细胞超微结构均有明显改善作用；BR1026umol+LPS1000ng/ml时，NRK52E细胞生长活性、细胞集落形成率、细胞间GJ传递功能及超微结构的伤害程度均明显大于LPS1000ng/ml组。 结论： 1.LPS对NRK52E细胞的生长活性、细胞增殖能力、细胞间GJ传递功能均具有明显浓度依赖性的抑制或伤害作用，并对NRK52E细胞超微结构造成明显损害，GJ激动剂能一定程度减弱LPS的细胞伤害作用。LPS对NRK52E细胞的伤害作用与细胞间GJ有关，GJ的功能变化是LPS对NRK52E细胞伤害及细胞功能抑制的重要机制之一。 2.BR从17.1umol至513umol对NRK52E细胞生长活性、增殖能力、细胞间GJ功能的促进作用逐渐增强，GJ阻断剂能一定程度拮抗BR的促进作用；BR从513umol至1026umol对NRK52E细胞生长活性、增殖能力、细胞间GJ功能的伤害作用逐渐增强，BR1026umol引起NRK52E细胞超微结构的明显损害，GJ激动剂能一定程度减弱BR的伤害作用。BR对NRK52E细胞的促进、伤害或抑制作用与细胞间GJ有关，可能是重要的机制之一。 3.BR513umol可以减轻LPS1000ng/ml对NRK52E细胞的生长活性、增殖能力、细胞间GJ功能、及细胞超微结构的伤害作用，并且与细胞间GJ有关；BR1026umol可以明显降低LPS1000ng/ml时NRK52E细胞的生长活性、增殖能力、细胞间GJ功能，并且增加对细胞超微结构的破坏损伤作用。