论文部分内容阅读
麝香为麝科动物林麝(Moschus berzovskii Flerov.)、马麝(M.sifanicus Przewalssi.)和原麝(M.moschiferus Linaeus.)成熟雄体脐下香腺囊分泌物的干燥品,具有开窍、醒神、活血通络、消肿止痛之功效,主治热病神昏、中风痰厥、气郁暴厥、中恶昏迷等,疗一切虚损恶病。现代研究表明麝香广泛的药理活性与其丰富的化学成分密切相关。然而,目前对其化学成分的研究多集中在弱极性化学成分上,对麝香化学组成缺乏系统全面的分析。为了系统地阐明麝香的化学组成,并建立有效的质量控制体系,本论文对麝香中化学成分进行了深入的定性、定量分析,主要取得了以下研究结果:1.通过二氯甲烷-甲醇-水(4:2:2)两相溶剂提取麝香,分别获得弱极性提取部位和极性提取部位。采用核磁共振(NMR)、气质联用(GC-MS)及合相色谱质谱联用系统(UC-MS)对麝香弱极性提取部位进行广泛的定性和定量分析。结果表明:养殖麝香与野生麝香的主要差异成分为脂肪酸类及甘油酯类化合物;养殖麝香中麝香酮的含量低于野生麝香;养殖麝香中甾体类化学成分的含量高于野生麝香。通过引入位移试剂以及采用非手性柱与手性柱在线串联的UC-MS系统(UFE-chiral-achiral-UFC-MS)证明野生麝香多通过人为添加油脂溶解的麝香酮来提高麝香酮的含量。2.分别采用NMR和串联反向-亲和作用色谱质谱联用系统(RPLC-HILIC-MS)定性分析麝香极性提取部位中化学成分。通过1HNMR、13C NMR、2D NMR结合HMDB数据库,初步鉴定了 22个化学成分;将各批次样品图谱转化为矩阵导入到多元统计分析软件,发现野生麝香与养殖麝香的极性化学成分轮廓存在显著差异,氨基酸类及有机酸类为主要差异成分。通过广泛收集化学对照品,并建立LC-MS分析方法,平行进样麝香极性提取部位,通过对比保留时间和离子对,发现20个化学成分。结合两种定性分析结果,共鉴定了 32种化学成分,主要包括氨基酸及有机酸类化合物。3.采用RPLC-HILIC-MS同步定量分析麝香中22个小分子化学成分,各分析物极性范围跨度大。结果表明:麝香甲醇提取物中既含有氨基酸、有机酸等极性化学成分,同时含有麝香酮及甾体类弱极性化学成分;野生麝香中氨基酸类、有机酸类化合物及麝香酮的含量均高于养殖麝香;野生麝香中丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸/异亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸及脯氨酸为主要氨基酸类成分,亮氨酸/异亮氨酸、精氨酸、缬氨酸、甘氨酸、苏氨酸为养殖麝香主要氨基酸类成分;养殖麝香中甾体类化合物的含量高于野生麝香。野生麝香中麝香酮的含量为2.0~4.6%,大部分养殖麝香中麝香酮含量低于2%。该方法可用于麝香的整体质量控制。4.采用BCA法测定养殖麝香与野生麝香中蛋白含量,发现两者之间无显著差异,蛋白含量占药材总重的3~5%;凝胶电泳图谱显示野生麝香与养殖麝香中均含有分子量约为70 kDa、50 kDa及25 kDa的条带,而养殖麝香在14~25 kDa之间具有多个条带。Swissprot数据库共对麝香中94个蛋白进行注释,其中共有蛋白74个,主要为角蛋白;19个蛋白为野生麝香特有,多为肌球蛋白;Serpin A3-4为养殖麝香特有。通过Sephadex G-50、G-100色谱柱,从麝香水提物中分离得到分子量为48.7 kDa的Keratin,type Ⅰcytoskeletal 15。总之,本项目基本阐明了麝香中小分子化学成分,并对蛋白质及多肽类成分进行了初步的揭示;建立天然麝香(包括野生麝香和养殖麝香)全面质量分析的方法;揭示了野生麝香和养殖麝香的化学成分组成存在一定差异;野生麝香多存在人为添加甘油三酯和麝香酮现象,于麝香样品中引入左旋麝香酮。这些结果的获得将为麝香化学物质基础和药效物质基础的阐明提供最直接的信息。