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肝细胞是肝内数量最多,体积最大的细胞群,约占肝脏细胞总量的80%。当肝细胞损伤时,会释放出一系列的细胞因子,激活肝星状细胞(Hepatic stellate cell, HSC),促使细胞外基质(extracellular matrix, ECM)异常增生,导致肝纤维化(Hepatic fibrosis)形成。肝细胞损伤在肝纤维化发生过程中起着非常重要的作用,尤其是肝细胞凋亡。寻找肝细胞保护药物将成为肝纤维化治疗的关键靶点。线粒体是细胞内活性氧(Reactive oxygen species, ROS)主要来源地,也是ROS氧化损伤的。因此寻找天然抗氧化物如中药或中药单体,清除细胞内过量的ROS,维持线粒体正常功能形态来保护肝细胞,是开启肝纤维化药物治疗的新途径。冬虫夏草又名虫草(Cordyceps sinensis)是一种名贵的药用真菌,具有抗炎症,抗癌症,抗衰老,增强免疫功能和调节生死等功能。越来越多研究表明在各种氧化应激引起的细胞损伤过程中,虫草起到一定的抗氧化作用,保护线粒体。由于虫草包含很多有效成分如虫草多糖,虫草素,虫草酸,生物碱,脂肪和脂肪酸等,具体哪种有效成分起抗氧化作用还尚不清楚。本研究主要从虫草中选取虫草多糖(Cordyceps polysaccharide, CPS),虫草素和虫草酸三种有效成分,研究它们对线粒体的保护作用。细胞活性实验筛选出最佳药物浓度,hoechst33258荧光染色检测细胞凋亡,同时检测了线粒体ROS,线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential, MMP),能量(Adenosine Triphosphate, ATP)合成,细胞色素C (Cytochrome C, Cyto C)释放,免疫迹印实验检测Bax和Bcl-2蛋白表达。实验结果显示CPS抑制过氧化氢诱导地肝细胞活性下降,抑制肝细胞凋亡,并且消除细胞内多余的ROS,维持MMP稳定,保证ATP正常合成,阻止Cyto C释放,并且下降Bax/Bcl-2比率,这些研究都表明虫草多糖发挥抗氧化活性保护线粒体不受损伤。虫草素不能阻止过氧化氢诱导地肝细胞活力下降,和虫草酸可以抑制细胞活力下降,虫草素和虫草酸对线粒体各项指标的保护作用都不是很显著。丹参(Salvia miltiorrhiza)是一种药用价值非常高的传统中药(Traditional Chinese Medicine, TCM),被广泛地用于治疗各种疾病如脑血管疾病、心血管疾病、心衰、肝硬化、肝纤维化等。大量研究表明丹参、丹参复方制剂及丹参有效成分在慢性肝病尤其是肝纤维化治疗起着非常重要,主要作用机制是丹参具有抗氧化活力,消除自由基,保护生物膜。以前研究发现丹参药理成分包括脂溶性成分和水溶性成分,丹参水溶性成分药理活性最显著,尤其是以丹参素为基本结构的酚酸类化合物抗氧化活性最强。本实验主要对丹参酚酸类化合物丹酚酸B(Salvia miltiorrhiza B, SalB)、原儿茶醛和丹参素钠进行线粒体保护研究。本部分采用的实验方法与虫草有效成分对线粒体保护作用研究相同。实验结果显示SalB抵制过氧化氢诱导地细胞活性下降,阻止细胞凋亡,消除细胞内多余的ROS,阻止MMP崩解,维持ATP正常合成,阻止Cyto C释放,降低Bax/Bcl-2匕值,抑制pro-caspase3的活化成cleave-caspase3,这些研究表明SalB发挥抗氧化作用,抑制过氧化氢诱导地线粒体凋亡,从而保护肝细胞。原儿茶醛和丹参素钠不能抑制细胞活力下降,但能消除细胞内多余ROS,对线粒体其他指标保护作用不能明显。在正常细胞内,线粒体相互连接形成管网状结构,并发生着频繁地融合与分裂。线粒体融合与分裂是由一系列蛋白介导的,二者之间的动态平衡维持着线粒体的形态和功能。当细胞受氧化应激刺激后,融合与分裂失衡,线粒体管网状结构碎裂,形成点泡状。Mortalin是HSP70家庭成员之一,主要定位于线粒体,参与应激反应、胞内运输、线粒体蛋白输入、调控细胞增殖和分化、细胞信号转导等生命活动。我们实验室以前研究发现mortalin高表达能够清除细胞内多余的ROS,维持线粒体膜电位稳定和ATP正常合成,阻止Cyto C释放,抑制Bax构象改变,抑制缺糖诱导地PC12细胞凋亡。第二部分实验结果发现SalB具有抗氧化作用,保护线粒体正常功能。但是mortalin和SalB是否通过维持线粒体融合与分裂之间地平衡来保护线粒体以及mortalin和SalB是否存在某种联系,这些机制都尚不清楚。本实验采用MTG标记线粒体,构建mortalin高表达与低表达质料,实时定量PCR检测线粒体融合分裂相关因子mRNA表达水平,免疫印迹检测了线粒体融合分裂相关因子蛋白表达水平。实验结果显示SalB和mortalin高表达抑制过氧化氢诱导地线粒体片段化,mortalin低表达不影响线粒体形态,过氧化氢处理后加剧线粒体片段化,SalB能够增加mortalin蛋白表达量。Mortalin高表达能够提高Mfn1和Opal mRNA表达水平,对Mfn2mRNA表达水平没有影响,降低Hfis1和MTP18mRNA表达水平,提高Drpl mRNA表达水平。SalB对Mfn2没有直接作用,提高Hfis1蛋白表达量,能够降低Bax/Bcl-2抑制凋亡。Mortalin高表达能够降低Bax/Bcl-2比值,降低Hfis1蛋白表达水平,对Drp1没有影响。综上所述,SalB能够通过增加mortalin蛋白表达.,mortalin通过调节Mfn1, Opal,Hfis1, MTP18和Drp1mRNA水平及Bax, Bcl-2, Hfis1及Drp1蛋白水平来维持线粒体融合分裂动态平衡。