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骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是一群存在于骨髓腔内的非造血干细胞,它们具有较强的自我更新能力和多向分化潜能,因取材方便,无伦理道德争议,目前被广泛用于组织损伤修复及基因工程领域。雌二醇(Estradiol,E2)是体内的最主要的类固醇雌激素,近年来研究发现,E2除了参与调节生殖功能外,还参与调控其他许多与生殖无关的生理过程。本实验以分离自1岁龄左右犬的BMSCs为材料,采用CCK-8、AnnexinV-FITC/PI、RT-qPCR等方法分析17β-雌二醇对犬BMSCs增殖及凋亡的影响,研究获得结果如下:1犬骨髓间充质干细胞的分离培养和鉴定试验采用全骨髓差速贴壁法与密度梯度离心法对犬BMSCs进行分离纯化。结果表明,全骨髓差速贴壁法和密度梯度离心法都能成功培养出犬BMSCs,但后者相对前者获得的细胞经培养后其原代细胞分布更匀一,原代细胞达到传代所需的时间更短,成活率更高;两种方法获得的第3代(P3)和第8代(P8)细胞的生长曲线基本一致;免疫组化结果显示所分离的细胞表达CD105、CD90和CD29,但不表达CD34和CD31;而流式细胞术结果显示密度梯度离心法分离的P3细胞94.77%表达CD29,89.53%表达CD90,93.87%表达CD105,全骨髓差速贴壁法所得细胞89.27%表达CD29,80.49%表达CD90,83.82%表达CD105相比较高;经诱导均能分化为成骨细胞和脂肪细胞。证明采用以上两种方法均能够成功分离和培养犬BMSCs,密度梯度离心法相比全骨髓差速贴壁法能更好地富集和纯化原代细胞。2 17β-雌二醇对犬骨髓间充质干细胞增殖及凋亡的影响分别在犬BMSCs体外培养的过程中添加10-7mol/L、10-9mol/L、10-11mol/L、10-13mol/L、10-15mol/L 的 17β-雌二醇,培养 3d 和 5d 后,经 CCK-8 和 Annexin V-FITC/PI检测得到的OD值及流式散点图,分析17β-雌二醇对BMSCs细胞增殖活性和凋亡的影响,结果如下:培养3d后,17β-雌二醇浓度为10-11mol/L、10-13mol/L、10-15mol/L时对BMSCs的活性和凋亡率都没有显著影响,而浓度为10-7mol/L和10-9mol/L则显著抑制BMSCs的活性(P<0.05),使细胞活力下降且凋亡显著增多(P<0.05),表明10-9mol/L及以上浓度的17β-雌二醇可抑制犬BMSCs的细胞活性,促进其凋亡,具有明显的细胞毒性效应;培养5d后,当浓度为10-7mol/L时,17β-雌二醇仍可显著促进其凋亡(P<0.05),但其他各浓度对BMSCs活性及凋亡率都无显著性影响。应用RT-qPCR检测分析17β-雌二醇对细胞增殖相关基因(PCNA、CCND1和CDKN1B)、凋亡相关基因(Bcl-2、Bax、Caspase-3和Caspase-8)和雌激素受体-α(ER-α)mRNA表达的影响,结果显示:培养3d后,10-11mol/L的17β-雌二醇组增殖相关基因PCNA和CCND1 mRNA的表达量显著高于其余各组(P<0.05),10-7mol/L的17β-雌二醇组凋亡相关基因Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA的表达量显著高于其余各组(P<0.05);培养5d后,17β-雌二醇对相关基因的表达都无显著性影响。对ER-αmRNA表达的分析可知:培养3d,10-7mol/L的17β-雌二醇可显著抑制其表达(P<0.05),但10-11mol/L则促进其表达,与对照组相比,差异极显著(P<0.01)。结果表明高浓度的17β-雌二醇可能通过抑制BMSCs细胞内增殖相关基因和ER-α mRNA表达,促进细胞内凋亡相关基因的表达,抑制BMSCs的增殖,17β-雌二醇浓度为10-7mol/L时,抑制作用最明显。适宜浓度(10-11mol/L)的17β-雌二醇可在不同程度上促进BMSCs的增殖。