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目的:观察行气活血中药预知子提取物对人HepG2肝癌细胞黏附、迁移和侵袭的抑制作用及相关机制。方法:(1)将不同浓度中药预知子提取物(ATKSE,0.6～3.0 mg/m L)作用于人HepG2肝癌细胞,同时采用整合素抑制剂Cilengitide(CIL,0.125～32μmol/L)作为对照,通过MTT法观察对该细胞增殖的影响,以获得合适的剂量用于后续实验;(2)设置空白对照组、ATKSE组(1.0 mg/m L)、CIL组(1.0μmol/L)以及半量联合用药组(ATKSE 0.5 mg/m L+CIL 0.5μmol/L),作用于HepG2细胞,观察对其细胞-基质黏附能力的影响;划痕实验观察对其迁移能力的影响;Transwell基质胶侵袭实验观察对其侵袭能力的影响;(3)扫描电镜(SEM)观察对其HepG2细胞表面超微结构的影响;(4)Western Blot技术观察对Integrin/Focal Adhesion通路上相关蛋白和基质金属蛋白酶的影响,包括ITGA2、ITGB5、ITGB1和ITGAV等整合素分子,FAK及其磷酸化蛋白p-FAK(Y397)和p-FAK(Y576+577),通路上其他相关分子如ERK1/2、Rhoa、p JNK和Ras,E-cad和N-cad等经典黏附分子,基质金属蛋白酶MMP2和MMP9;(5)进一步,使用FAK抑制剂PF-573224,设置空白对照组、ATKSE组(1.0 mg/m L)、FAK抑制剂组(FAKi 2.0μmol/L)、半量联合用药组(ATKSE 0.5 mg/m L+FAK i1.0μmol/L)以及全量联合组(ATKSE 1.0 mg/m L+FAKi 2.0μmol/L),作用于HepG2细胞,划痕和侵袭实验观察FAK抑制在预知子提取物影响人HepG2肝癌细胞迁移和侵袭能力中的作用。结果:(1)不同浓度ATKSE作用下,在0.6 mg/m L和0.9 mg/m L剂量下,HepG2细胞的形态和数量几乎没有什么变化;从1.2 mg/m L,细胞的数量相对减少;1.8 mg/m L剂量以上细胞数量锐减,状态变差,HepG2细胞特有的重叠生长特征消失,药物细胞毒作用凸显;(2)MTT结果显示,ATKSE作用于HepG2细胞株后,24h IC50的剂量约为2.59 mg/m L,48h IC50的剂量约为2.39 mg/m L,72h IC50的剂量约为2.0 mg/m L;Cilengitide(CIL)作用24h未能获得IC50剂量,48h IC50的剂量约为2.0μmol/L,72h IC50的剂量约为1.57μmol/L;ATKSE选择1.0 mg/m L,CIL选择1.0μmol/L用于后续实验;(3)细胞-基质黏附实验中,与空白对照组比较,各用药组黏附率呈下降趋势(P<0.05);黏附率(%)空白对照组100.00±4.94,ATKSE组为83.67±4.04,CIL组79.69±3.26,半量联合组78.64±2.71。(4)划痕实验中,与空白对照组比较,细胞的迁移能力有被抑制的趋势(P<0.05)。迁移率均值(%)空白对照组为10.32,ATKSE为3.10,CIL组为负值2.58,半量联合用药组为0.02。(5)侵袭实验中,用药后细胞穿孔数有下降的趋势。其中,空白对照组为173±20,ATKSE组为142±2,CIL组为130±19,半量联合用药组为90±13。以上各用药组与空白对照组间的差异有统计学意义(P<0.05);半量联合组显著低于ATKSE组和CIL组(P<0.05)。(6)SEM结果显示,空白对照组细胞总体增殖不算活跃,细胞表面多见纤毛缩短演变成吸盘状,但相对而言,细胞尚饱满。ATKSE组纤毛缩短趋势明显、长短不一、粗细不均、吸盘状有扩大趋势;CIL组细胞间连接两细胞的纤毛数量明显减少,少量细胞表明纤毛萎缩殆尽;半量联合组则综合了以上两组的各自特征,纤毛缩短趋势明显、长短不一。(7)WB结果显示,与空白对照组比较:ATKSE或CIL作用后,Integrin相关的蛋白出现类似的下降趋势,且半量联用后,ITGA2和ITGB5出现减量增效(P<0.05);ATKSE作用后p-FAK(Y397)、CIL作用后p-FAK(Y3576+577)表达量均下降(P<0.05)。CIL作用后E-cad表达量下降(P<0.05);ATKSE或CIL作用后,N-cad表达量上升(P<0.05)。ATKSE或CIL作用后,p-ERK1/2均出现下调趋势,且半量联用后存在减量增效效应(P<0.05);CIL作用或半量联合作用后,p-JNK表达量下降(P<0.05);ATKSE或CIL作用后,MMP2表达量降低(P<0.05)。(8)进一步采用FAK抑制剂进行的HepG2细胞迁移实验中,与空白对照组比较,各用药组迁移能力均出现下降(P<0.05)。各组迁移率(%)均值分别为空白对照组14.28,ATKSE组7.02,FAKi组2.93,半量联合组4.71,全量联合组为负值2.75。(9)侵袭实验中,与空白对照组100±10.03(%)比较,各用药组侵袭能力均出现下降(P<0.05),以全量联合组最甚。各用药组侵袭率分别为56.85±4.35、64.62±6.09、64.62±6.68和34.43±4.32。结论:(1)行气活血中药预知子提取物能抑制人HepG2肝癌细胞增殖、黏附、迁移和侵袭。(2)预知子提取物作用后,可影响HepG2肝癌细胞表面纤毛结构,从而使得细胞间紧密连接减弱。(3)以上作用,可能是通过以下机制实现的:抑制ITGA2、ITGB5和p FAK等Integrin/Focal Adhesion通路上游蛋白的表达,使下游p-ERK1/2、p-JNK等部分失活,进而间接或直接抑制MMP2等蛋白的表达,即通过抑制HepG2肝癌细胞的增殖、黏附、迁移和侵袭等各个环节,最终达到抑制其迁移侵袭的目的。(4)行气活血中药预知子和整合素抑制剂Cilengitide联用后,在抑制肝癌细胞侵袭方面,存在减量增效效应。但是,二者在作用机制上不尽相同。