CEAP分子标记开发及其在芒果种质资源分析中的应用

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分子标记是植物种质资源遗传多样性和亲缘关系分析的重要工具。新型分子标记的开发可以挖掘一些新的多态性位点,有利于种质资源评价与遗传多样性分析。顺式元件调控基因的表达水平,在植物基因组中保守且广泛存在,具有开发成新型分子标记的潜力。本研究以八个顺式元件基序作为引物核心,设计了一种基于顺式元件扩增多态性的靶向于启动子和基因区域的分子标记技术,命名为Cis-element amplified polymorphism(CEAP)。以不同物种为材料,验证了该标记在不同物种中的扩增通用性,比较了CEAP,ISSR,SRAP和CBDP标记对48份芒果资源遗传多样性和亲缘关系的分析,并进一步比较分析了CEAP与ISSR标记在192份芒果种质资源中的表现。具体结果如下:1.CEAP分子标记开发以8种顺式元件的保守序列为核心,开发了一种新型启动子和基因靶向扩增多态性分子标记,命名为CEAP分子标记。CEAP引物长度为18个核苷酸,以顺式元件核苷酸序列为核心,在5’端填充一段长度为9-12个核苷酸的序列,在3’端填充二核苷酸或三核苷酸,每类顺式元件设计了28条引物,总共设计了224条CEAP引物。PCR程序前5个退火循环为低温,随后35个退火循环保持为50°C。PCR产物使用1.8%-2.3%琼脂糖凝胶电泳进行分辨。对8个芒果种质资源进行PCR扩增,结果表明,CEAP引物能扩增出清晰、多态性较高的条带。根据非加权组平均法(UPGMA)法将所有供试芒果品种分为两组,最佳的组合方法为至少四类顺式元件,并从每类顺式元件引物选择六个扩增条带数和多态性高的引物。通过克隆和测序,验证了CEAP标记可以扩增来自启动子区域、启动子和基因区域、仅在基因区域、基因以及3’非编码区域的多态性。此外,CEAP标记扩增了水稻、番茄、马铃薯、冬瓜、柑橘和龙眼等物种,结果表明,CEAP标记在这些物种中扩增效果良好,具有物种通用性。2.CEAP、ISSR、SRAP和CBDP分子标记在48份芒果资源中的比较分析利用CEAP、ISSR、SRAP和CBDP 4种不同的分子标记,扩增48份芒果资源,结果显示,20条CEAP引物共扩增了180条条带,多态性百分比为96.11%;20条ISSR引物共扩增了171条条带,多态性百分比为86.55%;20对SRAP共扩增了154条条带,多态性百分比为87.66%;20条CBDP引物共扩增了158条条带,多态性百分比为87.97%。CEAP标记的多态性信息含量(PIC)、标记指数(MI)和分辨率(Rp)数值最高;CBDP和ISSR标记的Nei’遗传多样性(H)和香农信息指数(I)数值最高。UPGMA聚类分析结果表明,单一标记可以准确反映部分芒果样品的亲缘关系,但不能准确反映所有芒果样品的亲缘关系,当使用多个标记联合聚类来评价芒果的亲缘关系时,聚类结果相对于单一标记而言更准确。通过联合聚类分析,获得了9份芒果种质资源潜在的亲缘关系。3.CEAP和ISSR分子标记在192份芒果种质资源遗传多样性的应用利用CEAP和ISSR分子标记技术,扩增192份芒果种质资源的遗传多样性,各标记选择20条扩增清晰多态性高的引物进行扩增。结果表明,20条CEAP引物共扩增了160条条带,多态性百分比为95.63%;20条ISSR引物共扩增了178条条带,多态性百分比为96.07%。ISSR标记的多态性信息含量(PIC)、标记指数(MI)和分辨率(Rp)数值最高;CEAP标记的Nei’遗传多样性(H)和香农信息指数(I)数值最高。单个标记聚类分析显示,不同标记靶向的区域不同所反映芒果资源之间的亲缘关系是有差异的。通过综合UPGMA聚类分析,主成分分析(PCo A)以及种群结构分析结果显示,供试芒果材料被分为两个大类,所收集到的资源间存在着丰富的变异,获得了18份芒果资源潜在的亲缘关系。
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