角膜表面湿润,适于多种微生物生长,并共同构成眼表正常菌群。大多数情况下,微生物之间及微生物与宿主之间存在相互作用,以维持菌群相对稳定。当角膜受损或机体抵抗力降低时,这种稳定被打破,机会致病菌可穿过角膜上皮细胞,侵入角膜,引起角膜感染。伪中间葡萄球菌（Staphylococcus pseudintermedius,S.pseudintermedius）是犬结膜囊内的常在菌,在健康犬和患角膜炎犬结膜囊内都有较高的分离率,是造成犬角膜炎的主要机会致病菌。近十年来,S.pseudintermedius耐药性逐步上升,影响临床相关疾病的治疗效果。MCC950是一种含有二芳基磺酰脲的小分子化合物,是NLRP3炎性小体的特异性抑制剂,通过抑制NLRP3炎性小体的激活来抑制IL-1 β的成熟和分泌。目前,其治疗效果已在多种炎症相关疾病治疗中得到证实。在本研究中,利用S.pseudintermedius感染犬角膜上皮细胞（CCECs）和犬角膜基质细胞（CCSCs）制作炎症模型,并用MCC950进行处理,通过qRT-PCR、Western Blot和流式细胞术等方法探究MCC950对S.pseudintermedius诱导的细胞炎性反应和增殖相关信号通路及细胞因子的影响。通过将S.pseudintermedius注入犬角膜基质层建立伪中间葡萄球菌性角膜炎动物模型,通过裂隙灯检查、角膜组织石蜡切片、qRT-PCR、Western Blot及免疫组化等方法探究MCC950对犬伪中间葡萄球菌性角膜炎的作用,为临床上犬细菌性角膜炎的治疗提供新的靶点和理论依据。1.MCC950对犬伪中间葡萄球菌性角膜炎的疗效观察通过将S.pseudintermedius注入犬角膜基质层建立伪中间葡萄球菌性角膜炎动物模型。注菌12 h后开始治疗,空白对照组不进行任何处理,左氧氟沙星对照组和左氧氟沙星治疗组使用左氧氟沙星滴眼液进行治疗,MCC950对照组和MCC950治疗组在左氧氟沙星滴眼液基础上增加MCC950进行治疗,2滴/眼/次,间隔2 h一次,持续治疗36h。使用裂隙灯对犬角膜进行观察;采集角膜,一部分用于制作石蜡切片,一部分用于提取总RNA和总蛋白。通过HE染色观察角膜病理损伤情况,通过免疫组化技术和Western Blot检测相关蛋白表达情况,通过qRT-PCR检测相关细胞因子的mRNA表达。结果显示,S.pseudintermedius感染犬角膜基质层,造成角膜浑浊、水肿、并形成溃疡灶、出现新生血管并伴有大量中性粒细胞浸润基质层。病犬角膜IκBα和p65磷酸化水平及MyD88表达量极显著升高（p＜0.01）,ASC、caspase-1 p20、cleaved IL-1β和NLRP3表达量极显著升高（p＜0.01）;炎性细胞因子IL-1β、IL-18、IL-8、IL-6和TNF-α极显著升高（p＜0.01）;S.pseudiusntermedi感染激活了角膜NLRP3炎性小体和NF-κB信号通路。使用MCC950等药物后,上述病变得到改善,角膜炎性损伤减轻;上述蛋白和炎性因子的表达均极显著下降（p＜0.01）。2.犬角膜上皮细胞和基质细胞的分离培养及鉴定通过酶组合消化法结合组织块贴壁法,在体外分离培养原代犬角膜上皮细胞（CCECs）和犬角膜基质细胞（CCSCs）,并进行鉴定。方法是:手术无菌采集健康比格犬角膜的上皮层和部分基质层,用1.2IU/mL的dispaseⅡ酶将上皮层和基质层分离,上皮层剪碎后接种到细胞瓶培养,用CCK-8法测定细胞生长曲线,用免疫荧光法检测细胞角蛋白12。用0.25%Ⅰ型胶原酶对基质层进行消化,制成单细胞悬液,收集细胞后接种到细胞瓶,用CCK-8法测定细胞生长曲线,用免疫荧光法检测细胞波形蛋白。CCECs和CCSCs均表现出较好的增殖活力,免疫荧光结果显示CCECs表达角蛋白12,CCSCs表达波形蛋白,说明成功分离并纯化了 CCECs和CCSCs。3.MCC950对S.pseudintermedius诱导的 CCECs 和 CCSCs NF-κB 信号通路及 NLRP3炎性小体的影响用 50 μmol/L PDTC、10 μmol/L MCC950 和 50 μμmol/L PDTC+10 μmol/L MCC950 预处理 CCECs 1 h,用 20 μmol/L PDTC、10 μmol/LMCC950 和 20 μmol/LPDTC+10 μmol/L MCC950预处理CCSCs 1 h,按照MOI=1:1加入对数生长期的S.pseudintermedius 1×106 CFU,继续培养不同时间后收集细胞,通过qRT-PCR检测细胞炎性因子,用Western Blot检测NF-κB信号通路及NLRP3炎性小体相关蛋白表达情况,取细胞培养上清和细胞分别检测细胞乳酸脱氢酶（LDH）释放量和丙二醛（MDA）含量。结果显示,与对照组相比,S.pseudintermedius组p65和IκBα磷酸化水平极显著升高（p＜0.01）;NLRP3、ASC、caspase-1 p20 和 cleaved IL-1β 蛋白表达量极显著升高（p＜0.01）;IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18、TNF-α、NLRP3、ASC 和caspase-1的 mRNA 表达量均极显著升高（p＜0.01）;细胞MDA含量和LDH释放量极显著增加（p＜0.01）。用PDTC和MCC950 处理后,p65 和 IκBα 磷酸化水平极显著降低（p＜0.01）;NLRP3、ASC、caspase-1 p20和cleaved IL-1β蛋白表达量极显著降低（p＜0.01）;IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18、TNF-α、NLRP3、ASC和caspase-1的mRNA表达量均极显著降低（p＜0.01）;细胞MDA含量和LDH释放量极显著降低（p＜0.01）。说明MCC950能抑制S.pseudintermedius诱导的细胞NF-κB信号通路及NLRP3炎性小体的激活,降低细胞炎性反应。4.MCC950对S.pseudintermedius诱导的 CCECs 和 CCSCs 增殖的影响用10 μmol/L MCC950预处理CCECs和CCSCs 1 h,按照MOI=1:1加入对数生长期的S.pseudintermedius 1×106 CFU,继续培养不同时间后收集细胞,通过qRT-PCR检测细胞生长因子,用Western Blot检测PI3K/AKT信号通路和Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达情况,用流式细胞术检测细胞周期变化。结果显示,与control组相比,S.pseudintermedius组PI3K 和 AKT 的磷酸化水平极显著升高（p＜0.01）;β-catenin、c-Myc和CyclinD1的蛋白表达水平极显著升高（p＜0.01）;EGF、FGF、TGF-β1、VEGF和CTGF的mRNA表达量均极显著升高（p＜0.01）;S期细胞极显著增多（p＜0.01）,G2期细胞显著减少（p＜0.05）。与S.pseudintermedius组相比,MCC950组PI3K和AKT的磷酸化水平极显著降低（p＜0.01）;β-catenin、c-Myc和CyclinD1的蛋白表达量均极显著降低（p＜0.01）;EGF、FGF、TGF-β1、VEGF和CTGF的mRNA表达量均极显著降低（p＜0.01）;S期细胞极显著减少（p＜0.01）。综上所述,MCC950抑制S.pseudintermedius诱导的CCECs、CCSCs和角膜组织的NF-κB信号通路及NLRP3炎性小体的激活,抑制炎性细胞因子的表达,降低炎性损伤,且MCC950还通过抑制S.pseudintermedius诱导的CCECs和CCSCs的PI3K/AKT和Wnt/β-catenin信号通路的激活,降低相关增殖因子的表达,避免角膜纤维化愈合以及瘢痕形成。故MCC950可减轻角膜炎性反应并有利于角膜愈合。