次氯酸(HOCl)是生物体内重要的活性氧之一,是在髓过氧化物酶(MPO)的催化下由H2O2和Cl-反应而生成的。它在众多生理活动中发挥着重要作用,是生物抵御细菌入侵的天然屏障。生物体内HOCl不受控制的产生可能与某些疾病密切相关。可是到目前为止,由于受检测手段的限制,次氯酸在这些疾病中扮演的具体角色尚不清楚。因此,为了清楚地了解HOCl在生理活动中的作用,预防和治疗各种疾病,发展高灵敏度的、即时性的HOCl检测方法显得尤为重要,也是世界科学家们所面临的一种挑战。荧光探针技术因其选择性好、灵敏度高、操作简单、响应快、组织损伤小等诸多优点,无疑是解决这一难题的有效手段。因此基于荧光探针技术来检测生物体内HOCl的方法迅速发展,有关次氯酸荧光探针的文献报道迅速增多。在这些次氯酸探针中多数是基于单荧光发射的探针,它们易受环境、探针浓度以及激发光强度变化的影响,而导致测量的准确度下降；尤其是较小的斯托克斯位移严重影响着细胞的成像分辨率。然而,荧光比率探针拥有双荧光发射,增加了自身修正功能,能够很好地消除来自环境、探针浓度及激发光强度变化的干扰；更重要的是荧光比率探针拥有较大的伪-斯托克斯位移,这将大大提高细胞的成像分辨率,因此荧光比率探针无疑是解决上述问题的上佳选择。罗丹明类荧光团具有诸多优异的光化学性质,如较大的摩尔消光系数、较高的量子产率、可见光区域内的吸收和发射以及优良的光稳定性,所以在各类探针的设计中被广泛应用。其设计原理主要是通过螺环控制氧杂蒽的共轭体系来调节荧光发射。当探针螺环关闭时,氧杂蒽结构处于非共轭体系,因此无荧光发射；当与被检测物作用时,探针螺环被打开,氧杂蒽结构转化为共轭体系,因此有荧光发射；探针由无荧光到有荧光,此谓荧光增强(turn on)型探针。反之,当螺环由打开到关闭,氧杂蒽结构由共轭到非共轭,探针则由有荧光到无荧光,谓之为荧光淬灭(turn off)型探针。正因为该荧光团的荧光发射机理明确,所以这为该类荧光团探针的设计提供了明确思路。此外,据有关文献报道,生物体内的髓过氧化物酶MPO在酸性条件下具有更高的活性,有利于催化H202与Cl-反应而生成HoCl,故推测生物体内的HOCl极有可能是在酸性条件下生成的。因此,发展适用于酸性条件下的次氯酸荧光探针对检测生物体内的次氯酸来源具有重要的意义。鉴于开发次氯酸荧光探针的重要意义以及荧光比率探针的独特优势,本论文主要致力于次氯酸荧光比率探针的研究。设计、合成了一系列基于罗丹明类荧光团的次氯酸荧光比率探针CRH、CRA、Naph-Rh、CRSH、CARSH和DRSH,以及一种Hg2+荧光探针RDH,并对它们的光谱性质及应用进行了系统的研究。第一章,简述了发展次氯酸荧光探针的重要意义；简单介绍了荧光探针的识别机理及罗丹明类荧光团探针的设计原理；总结了次氯酸探针的研究进展。第二章,设计了两个基于香豆素与罗丹明双荧光团的次氯酸荧光比率探针CRH与CRA。其中,CRH以双酰肼为识别团,能够在碱性条件下对-OC1做出快速响应；CRA则直接以罗丹明酸为识别基团,能够在酸性条件下对HOCl做出快速响应。研究结果表明探针CRH与CRA对OCl/HOCl表现出极高的选择性和灵敏性。第三章,设计了基于TBET原理的次氯酸荧光比率探针Naph-Rh。该探针将萘甲酰基与罗丹明硫代酰肼相连接构建了单硫代双酰肼结构。单硫代双酰肼与HOCl作用后,生成噁二唑环,不仅转化为共轭体系,而且诱导了罗丹明部分的螺环打开,使供体与受体之间建立起TBET过程。研究结果表明该探针选择性好、灵敏度高、响应快、适用于细胞的内源性HOCl的检测。第四章,设计了基于FRET原理的次氯酸荧光比率探针CRSH。该探针以香豆素与罗丹明为荧光母体,硫代酰肼为检测基团,在酸性条件下能够与HOCl较快地发生作用而引起荧光团的荧光变化,从而达到检测HOCl的目的。研究结果显示该探针具有良好的选择性、较高的灵敏度、优异的灵敏性、极强的膜透性以及良好的稳定性,能够很好地应用于细胞内HOCl的检测。第五章,在CRSH探针的基础上,为了增加供体发射峰与受体吸收峰之间的有效重叠面积,提高能量转移效率,我们设计、合成了两种基于FRET原理的次氯酸荧光比率探针CARSH与DRSH。在这两个探针中,我们选择了发射波更长的荧光团(香豆素丙烯酰基与丹磺酰基)作为能量供体与罗丹明荧光团受体匹配建立了新的FRET模板。能量转移效率计算结果显示新模板有效地促进了供体与受体之间的能量转移。第六章,基于罗丹醇荧光团,设计了一种结构简单的Hg2+荧光探针RDH,并对其光谱性质及细胞应用进行了研究。研究结果表明探针RDH选择性高、灵敏度好、抗干扰能力强、细胞毒性低,适宜应用于细胞内Hg2+的检测。本论文主要创新点：1、基于FRET、TBET原理,选择了不同的供体荧光团与罗丹明类荧光团搭配,设计了一系列适用于酸性条件下的次氯酸荧光比率探针CRA、Naph-Rh、 CRSH、CARSH及DRSH。在酸性条件下,生物体内MPO能够更有效催化生成HOCl,因此发展适用于酸性条件下的次氯酸荧光探针对研究生物体内的次氯酸来源具有重要意义,但是,检测酸性条件下的次氯酸的荧光探针尚不多见。本论文发展的探针在酸性条件下能够对HOCl做出快速响应,并适用于细胞内HOCl成像。这些比率探针在消除环境、浓度、激发光强度变化的干扰,以及提高细胞成像的分辨率等方面具有明显优势。2、发展了首个基于第三代罗丹明类FRET模板的次氯酸荧光比率探针CRH(香豆素-罗丹明双酰肼)。在对探针CRH的光谱性质研究中发现,当-OCl浓度超过一定量时,两个荧光发射峰的升降发生逆反,本文对这一现象做了进一步研究,研究发现CRH与OCl反应的产物(香豆素-罗丹明酸,CRA)能够进一步发生氯代反应。氯代反应诱导了罗丹明部分的螺环重新关闭,从而导致荧光发射的逆转。我们据此机理(氯代诱导罗丹明关环)将CRA开发为了一种新型检测机理的次氯酸荧光比率探针,它能够在酸性条件下对HOCl快速响应,且适用于细胞内源性HOCl成像。3、探针Naph-Rh是首个基于TBET原理的次氯酸荧光比率探针,弥补了基于该原理的次氯酸探针的空白。该探针以发射波长较短的萘荧光团作为能量供体,在能量转移效率较高(84%)的前提下,显著增加了伪-Stokes位移(235 nnm),有利于提高细胞成像的分辨率。4、为了增大供体发射峰与受体吸收峰之间的重叠,提高能量转移效率,在探针CRSH的基础上,我们采用了发射波长更长的荧光团(香豆素丙烯酰基与丹磺酰基)为能量供体,设计了两个次氯酸荧光比率探针CARSH与DRSH,这两个探针同样适用于酸性条件下检测次氯酸,且它们的能量转移效率较CRSH有所提高。