论文部分内容阅读
目的:研究Ⅱ型单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus type2，HSV-2)UL27、UL54基因的重组表达载体shRNA(small hairpin RNA, shRNA)的干扰作用，并探讨二者联合干扰对HSV-2复制的影响。
方法:构建的UL54、UL27基因的shRNA表达载体，通过脂质体介导重组表达载体转染HEK293细胞，采用荧光倒置显微镜和流式细胞仪检测转染效率，用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测细胞存活率，通过shRNA重组表达载体和转染试剂lipofectamine2000不同剂量比例对转染效率的优化，找出转染效率较高且细胞毒性较低的shRNA重组表达载体与lipofectamine2000的最佳配比。shRNA重组表达载体转染HEK293细胞后接种HSV-2。采用实时荧光定量PCR(Real-timefluorescent quantitative PCR)检测HSV-2 UL27、UL54mRNA的表达水平，终点滴定法检测细胞上清液中的病毒滴度，MTT比色法检测细胞存活率，蛋白印迹法(Western blot)检测相应功能蛋白的表达情况，确定UL27、UL54不同靶基因的干扰效率，筛选出UL27、UL54单干扰效率较高的shRNA重组表达载体，并进行联合干扰实验，观察联合干扰对HSV-2复制的影响。
结果:(1)根据转染效率以及细胞存活率测定结果，筛选出质粒与转染试剂复合物的最佳配比为0.8μg∶2μl。(2)实时荧光定量PCR结果显示，UL27、UL54各单干扰组均能不同程度的抑制目的基因mRNA的表达，其中UL27 shRNA75组和UL27 shRNA2265组对UL27mRNA表达抑制率分别为75.17％、60.22％，UL54shRNA1081组、UL54 shRNA1407组对UL54mRNA表达抑制率分别为69.61％、51.46％，与空白对照组相比均具有显著性差异(P＜0.05);联合干扰UL27 shRNA75+UL54 shRNA1081组对目的基因mRNA表达有明显的降低，抑制效果最佳，对UL27基因mRNA表达抑制率约为88.10％，对UL54基因mRNA表达降低，抑制率约为85.53％，与对照组和单干扰组比较都具有显著性差异(P＜0.05)。(3)终点滴定法结果显示:各干扰组可不同程度降低上清液中的子代病毒感染滴度，其中联合干扰UL27 shRNA75+UL54 shRNA1081组降低病毒滴度最明显，与空白组比较差异性显著(P＜0.01)。(4) MTT法检测结果显示，与阴性对照组相比，单干扰组和联合干扰组可不同程度提高细胞存活率，其中UL27 shRNA75+UL54shRNA1081、UL27 shRNA75+UL54 shRNA1407组细胞存活率明显提高，分别为97.3±0.91％、95.7±1.14％，差异有显著意义(P＜0.05)。(5) Western blot检测目的基因蛋白，单干扰组与联合干扰组可不同程度降低靶基因蛋白的表达，其中UL27shRNA75+UL54 shRNA1081联合干扰组能显著抑制相应的蛋白表达水平，蛋白表达量明显减少，与单干扰组相比具有显著差异(P＜0.05)。
结论:构建的pGPU6/GFP/Neo-UL27、pGPU6/GFP/Neo-UL54重组表达载体，均能在细胞水平上不同程度的干扰HSV-2 UL27、UL54基因mRNA的表达，采用UL27、UL54基因联合具有更高的干扰效率，能更好的抑制HSV-2在HEK293细胞中复制。