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随着生活水平的提高,人类健康受到越来越多慢性疾病的威胁。如何提高人体自身修复能力成了研究的热门。慢性疾病中的动脉粥样硬化逐步成为人们研究的重点。长期以来,人们围绕此问题建立了多种动物模型来研究其发病的机理,提出了许多发病学说,但是其中的分子机制还不完全清楚。此疾病治疗涉及对血管内脂质的清除以及血管坏死部位的修复。在人体内参与了这两个过程的细胞最主要的是巨噬细胞和骨髓间充质干细胞。这两种细胞从身体其他部位到达血管病症处并发挥自己功能涉及了多个生物学的过程,包括巨噬细胞在血管壁上的迁移,对脂质的吞噬,促发的炎症反应以及骨髓间充质干细胞(BMMSCs)的增殖和血管中的迁移。巨噬细胞和骨髓间充质干细胞的这些行为都是细胞能量代谢的过程,其中就包括多种信号蛋白的磷酸化和去磷酸化过程。Wip1为新近被发现的一种丝氨酸/苏氨酸磷酸酶参与了多种信号通路的去磷酸化过程。研究发现敲除该基因后能降低动脉粥样硬化的症状。阐明这个生理过程的分子机制,对将来研究针对动脉粥样硬化新的靶向治疗药物具有重要的意义。本论文选取Wip1-/-和Wip-WT小鼠为实验动物,研究Wip1影响巨噬细胞迁移、吞噬和炎症反应以及影响骨髓间充质干细胞增殖和迁移的分子机制。主要进行了以下几个方面的研究:(1)检测Wip1对巨噬细胞体外和体内迁移的影响及信号通路研究;(2)检测Wip1对巨噬细胞伪足的形成的影响;(3)Wip1影响巨噬细胞吞噬及通路研究;(4)检测Wip1对巨噬细胞炎症反应的影响;(5)检测Wip1对骨髓间充质干细胞体外增殖的影响及机制的研究;(6)检测Wip1对骨髓间充质干细胞体外迁移的影响及通路研究。综合本论文的研究成果,得出以下几个主要结果:(1)Wip1敲除后提高了巨噬细胞Rac1-GTPase的活性,以及pAKT的表达从而促进了巨噬细胞体内、体外的迁移。细胞的极化及伪足的形成与Rac1活性相关。PI3K/AKT通路中AKT的磷酸化程度和细胞迁移相关,其磷酸化升高促进细胞迁移。Wip1敲除后不仅提高了Rac1-GTPase的活性也促进了 AKT的磷酸化,从而促进了巨噬细胞的迁移。(2)在巨噬细胞中Wip1负反馈调节AKT活性。在巨噬细胞中分别加入PI3K/AKT通路的抑制剂和激活剂,Wip1的表达量随着通路被抑制而下降,激活而升高。结合之前发现在Wip1敲除的巨噬细胞中pAKT表达量相对野生型较高,不难得出在巨噬细胞中Wip1负反馈调节AKT活性,但通路中是否含有Rac1值得进一步研究。(3)Wip1通过AMPK通路影响巨噬细胞清道夫受体(CD36)的募集。通过对Wip1-WT和Wip1-/-巨噬细胞的流式筛选中发现,在相同的细胞数下能筛选到更多的Wip1-/-巨噬细胞。因此对与巨噬细胞吞噬有关的表面特异性抗原进行流式分析,发现Wip1-/-巨噬细胞CD36的表达量较Wip1-WT巨噬细胞高。对巨噬细胞AMPK和CD36(膜蛋白中)的蛋白质免疫印迹发现Wip1-/-巨噬细胞pAMPK和CD36的相对表达量都比野生型高。经过对AMPK通路使用抑制剂和激活剂后,发现CD36在巨噬细胞膜蛋白中的表达受AMPK调控,两者正相关。(4)Wip1敲除后促进巨噬细胞的炎症反应。巨噬细胞炎症反应的标志是炎性因子的释放。在体外培养的巨噬细胞中加入LPS诱导巨噬细胞产生炎症反应,结果发现Wip1-/-巨噬细胞上清液中炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β的量在1h、3h、6h均高于其在Wip-WT巨噬细胞上清液中的含量。即Wip1敲除后促进了巨噬细胞的炎症反应。(5)Wip1敲除后抑制了 BMMSCs的体外繁殖,导致其早衰的出现。通过对BMMSCs传代时间记录和细胞增殖实验发现,Wip1-/-BMMSCs传代至第三代后细胞生长放缓。经细胞周期分析发现Wip1-/-BMMSCs出现G2期阻滞。Cyclin B1是细胞G2/M关键蛋白,它形成的复合物关系着细胞能顺利进入有丝分裂期。对Wip1-WT和Wip1-/-BMMSCs中cyclinB1蛋白表达进行分析发现,其在Wip1-/-BMMSCs表达量很低。细胞继续传到第6代时Wip1-/-BMMSCs几乎停止生长,细胞及胞核变大。β-半乳糖苷酶染色发现从第五代起已经出现部分细胞的早衰,至第6代大部分细胞出现早衰。(6)Wip1敲除后激活BMMSCs PI3K/AKT/Rac1通路促进了其体外迁移。通过划痕和transwell实验发现Wip1-/-BMMSCs的体外迁移能力强于Wip1-WT BMMSCs。Wip-/-BMMSCs 中 pAKT 表达量和 Rac1-GTPase 活性均高于Wip1-WTDMMSCs。加入PI3K/AKT通路抑制剂和Rac1抑制剂后,其迁移能力均下降。和巨噬细胞不一样的是,当加入PI3K/AKT通路抑制剂后Rac1的活性也降低。说明在BMMSCs中wip1可能通过PI3K/AKT/Rac1通路调控其迁移能力。本文的结果为揭示Wip1影响巨噬细胞迁移、吞噬和炎症反应及骨髓间充质干细胞迁移、增殖的分子机制提供了新线索,有利于对动脉粥样硬化发病机制的进一步阐明,为将来研发治疗动脉粥样硬化疾病的药物提供新的靶标。