[目的]维生素D受体(VDR)是一种核受体,在细胞核内与配体1,25(OH)2D3结合后,结合于目标基因的VDR反应元件(VDRE),启动基因的表达。VDR缺陷的人和鼠均表现出表皮和毛囊生长发育的异常。本课题旨在研究VDR在调节鼠表皮和毛囊细胞增殖分化中的作用及机制,为临床进一步探索人类VDR相关性皮肤和毛发疾病的发病机理和新治疗手段提供基础。[方法]1.构建VDR基因敲除鼠(VDR KO),观察VDR基因功能性缺失对鼠表皮和毛囊生长发育的影响,并重新转染人类VDR(hVDR)基因片段加以验证。用HE染色观察VDR基因敲除和重新转染hVDR后鼠表皮和毛囊的组织学改变,并用RT-PCR方法检测皮肤中与细胞增殖分化有关的基因如FLG、LOR、K10、K14、Ki-67在VDR敲除前后表达的影响。在离体培养的角质形成细胞中观察WT与KO鼠细胞在体外增殖分化行为方面的差异,并通过制造皮肤伤口观察伤口愈合过程中WT与KO鼠在愈合速度、细胞增殖层次、BrdU染色阳性细胞数和细胞分化指标Involucrin表达上的差异。最后用免疫荧光法检测WT与KO鼠中毛囊干细胞的定位特征,并用流式细胞法分选出生后18天的WT和KO鼠中CD34和CD49f双标阳性的毛囊干细胞,定量比较VDR基因敲除对鼠毛囊干细胞的影响。2.用拔毛法诱导鼠的毛囊生长期,用RT-PCR方法检测拔毛前后WT与KO鼠中Shh和cWnt通路目标基因包括Shh、Gli1、Ptc2,Msx2、wifl的表达变化。然后用Shh通路激动剂(SAG)外用于鼠皮肤,观察Shh通路激活对鼠皮肤组织中cWnt和Shh下游目标基因表达的影响。最后用CHIP-RT-PCR方法检测VDR与cWnt和Shh通路目标基因DNA启动调节区的结合情况,以探讨VDR如何参与调控cWnt和Shh通路间的交叉对话作用。3.用免疫荧光法检测出生后不同年龄阶段和毛囊周期中表皮和毛囊细胞中DDIT4的动态表达情况,然后用RT-PCR法检测VDR基因敲除对鼠角质形成细胞和毛囊干细胞中DDIT4的表达影响,并再转染hVDR加以验证。检测皮肤伤口愈合过程中,DDIT4在WT和KO鼠伤口周缘新生组织中的表达差异,观察DDIT4在VDR基因敲除前后对皮肤伤口愈合的影响；然后用不同浓度的1,25(OH)2D3刺激离体培养的WT和KO鼠角质形成细胞,观察DDIT4的诱导表达与VDR配体1,25(OH)2D3之间是否具有浓度依赖性。最后用CHIP-RT-PCR法检测VDR与DDIT4基因启动区的结合情况,以明确VDR如何参与DDIT4-cWnt-Shh通路之间的复杂网络调节作用。[结果]1.在特异性敲除VDR BD区域第二个锌指片段的氨基酸序列后,发现VDR的功能性丧失导致了KO鼠出现皮肤和毛囊发育的明显异常,表现为表皮增殖过度、毛囊角化、毛发脱落伴表皮囊肿形成；在重新转染hVDR后,这种现象得以纠正。基因检测结果显示,在KO鼠中,FLG、LOR、K10的基因表达明显下调,K14未见变化,而Ki-67基因表达上升。在皮肤伤口愈合中,KO鼠在术后中期的生长速度快于WT鼠,伤口边缘新生的表皮细胞层数及BrdU染色阳性细胞数也明显增多,但反应细胞分化的指标Involucrin则低于WT组。流式细胞术分选结果显示,出生后18天的KO鼠中CD34和CD49f双标阳性的毛囊干细胞数目显著低于WT,表明KO鼠在出生后毛囊形态发生周期完成后即出现毛囊干细胞的进行性减少。2. VDR KO鼠存在由拔毛法诱导的生长期形成障碍,表现为在拔毛后无毛发再生。基因检测结果显示,在拔毛后KO鼠中cWnt和Shh通路反应出现异常,表现为Shh通路的相关基因如Shh、Gli1、Ptc2,以及cWnt通路的相关基因Msx2和wif1不能被诱导表达。给予SAG刺激毛发生长后,16天和7周龄KO鼠对SAG的刺激无反应,而WT有明显新发生成。SAG刺激后WT鼠中Wif1、Gli1、Shh、Ptc2的基因表达上调,有较多BrdU染色阳性的毛囊角质形成细胞生成,而KO鼠的毛囊仅见到少数处于增殖状态的BrdU阳性细胞。进一步的CHIP-RT-PCR分析表明,VDR明显地富集在WT鼠的Shh下游基因Gli1和cWnt下游基因Axin2、cMYC,以及OC基因的启动调节区；但KO鼠却没有类似的结合现象,提示VDR通过与cWnt、Shh目标基因的启动区相结合而参与二者基因的表达调控。3. DDIT4动态地参与了鼠表皮生长和毛囊周期循环过程。在WT鼠第一个退行期,随着毛囊细胞的增殖和蛋白合成能力下降,DDIT4出现高表达；在转入生长期后表达降低；再次进入休止期后表达又重新上调。而在KO鼠,由于VDR的敲除,DDIT4失去这种动态变化特征。RT-PCR和Western blot结果也证实,在体外培养的角质形成细胞中DDIT4在KO中的表达量低于WT,在转染hVDR后上升。在经流式筛选的毛囊干细胞中WT鼠DDIT4表达却低于KO。且VDR在表皮细胞中对DDIT4的表达调控具有配体影响性,受1,25(OH)2D3的正向促进。在皮肤伤口愈合中,DDIT4在伤后中期主要表达于WT鼠的基底层,强度高于KO鼠,这也与第一部分实验中观察到的伤后中期KO鼠的表皮细胞增殖快于WT相符。CHIP-RT-PCR分析显示,VDR与DDIT4 DNA启动区有明显结合,其中以-963～-1154bp处的结合能力最强,并且也受1,25(OH)2D3的正向促进,表明VDR可通过与DDIT4启动区的基因调节序列相结合而调控其表达,参与了鼠的表皮和毛囊分化发育过程。[结论]1.VDR参与了调控鼠表皮和毛囊的生长发育。在VDR基因敲除后,KO鼠出现表皮过度增殖、皮内囊肿形成和毛发脱失,并且是一种非配体和钙磷代谢依赖的行为,其原因可能与VDR基因敲除导致了多种细胞增殖分化有关基因的表达障碍有关,而且KO鼠的毛囊干细胞在出生后18天即开始出现减少。2.在角质形成细胞中,VDR通过与cWnt和Shh通路目标基因的DNA启动调节区相结合,而启动对通路的表达调控,从而形成了VDR-cWnt-Shh通路之间的交叉对话,共同调控表皮和毛囊细胞的增殖分化。3. DDIT4参与了鼠表皮发育和毛囊周期的动态循环过程。DDIT4在Bugle处的持续高表达可能与干细胞的功能状态维护有关,且KO鼠毛囊干细胞内的DDIT4表达较WT高,这可能参与了对出生后KO鼠毛囊干细胞的功能抑制。VDR可结合于DDIT4 DNA启动区-963--1154bp位置而调控DDIT4的表达,并受1,25(OH)2D3的正向促进。由于cWnt、Shh处于DDIT4的下游,因而它们之间可能进一步形成了VDR-DDIT4-cWnt-Shh的更大作用网络,从而共同参与VDR在鼠表皮和毛囊发育的调控作用。