论文部分内容阅读
甲基乙二醛(Methylglyoxal,MGO)是一种内源性代谢的活性羰基化合物,易与蛋白质的氨基酸残基反应生成晚期糖基化终末产物(Advanced glycation end products,AGEs),可以诱导细胞羰基应激和氧化应激,导致细胞损伤。MGO以及AGEs的积累在糖尿病血管并发症、肾病等疾病中起到关键作用,抑制MGO的细胞毒性对以上疾病的防控尤为重要。MGO的细胞毒性机制主要是AGEs-RAGE(AGEs receptor),促进活性氧(Reactive oxygen species,ROS)生成,诱导线粒体损伤和细胞凋亡,但对于细胞凋亡的机制尚未详细阐述。线粒体膜通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)开放在线粒体依赖的细胞凋亡中起到关键,但MGO能否诱导mPTP及其机制尚不清楚。糖原合酶激酶3β(Glycogen synthase kinase 3β,GSK3β)是目前调控mPTP的重要调节蛋白,被激活后可以诱导线粒体膜上的己糖激酶II(HexokinaseII,HKII)从线粒体脱离而引起mPTP开放。本研究将以EA.hy926细胞为模型,以线粒体膜通透性转换孔为靶点,从AGEs-RAGE、氧化应激阐述MGO引起的细胞毒性机制。结果如下:1.通过3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide(MTT)、台盼蓝染色法检测MGO的细胞毒性,罗丹明123检测线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential,MMP)变化、DCFH-DA探针检测ROS、线粒体基质肿胀、流式细胞仪检测细胞凋亡,探讨MGO引起细胞毒性的机制。结果显示随着MGO浓度的增加,细胞活力降低,细胞毒性增强,线粒体MMP降低、细胞ROS增加、线粒体基质肿胀、细胞凋亡,且都呈现浓度依赖效应。而且加入羰基捕获剂氨基胍(Aminoguanidine,AG)、活性氧抑制剂4-Hydroxy-TEMPO(TEMPOL)以及GSK3β抑制剂SB216763、LiCl,均可显著抑制MGO的这种作用。2.Westren blot检测细胞内非荧光AGEs羧甲基赖氨酸(N-ε-carboxymethyl-lysine,CML)及其受体RAGE、GSK3β激酶9位丝氨酸磷酸化的蛋白水平以及HKII在线粒体内的蛋白水平表达。结果显示随着MGO浓度的增加,CML、RAGE蛋白表达水平显著增加,而羰基捕获剂AG、活性氧抑制剂TEMPOL显著抑制MGO诱导的CML、RAGE蛋白表达水平的增加;相反,随着MGO浓度的增加,GSK3β激酶9位丝氨酸磷酸化蛋白表达水平显著减少,但此蛋白表达水平的减少可被AG、TEMPOL和GSK3β抑制剂SB216763显著抑制;0.5 mM和1 mM MGO引起线粒体内HKII蛋白水平表达显著减少,而羰基捕获剂AG、活性氧抑制剂TEMPOL以及GSK3β抑制剂SB216763和LiCl显著抑制MGO引起的线粒体内HKII蛋白水平表达显著减少。综上所述,MGO引起EA.hy926细胞毒性,其毒性机制可能与线粒体损伤、细胞凋亡相关。进一步实验证明MGO引起细胞凋亡的毒性机制与线粒体膜通透性转换孔有关,可能的机制是(1)MGO通过CML-RAGE通路激活GSK3β作用于线粒体膜通透性转换孔;(2)MGO诱导的氧化应激作用于GSK3β而诱导线粒体膜通透性改变;(3)MGO诱导的氧化应激直接调控mPTP。