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骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)具有多向分化潜能。在不同培养条件下,MSCs能分化成为多种细胞。越来越多的证据表明,MSCs具有广阔的临床应用前景。除了易于分离获取、体外增殖潜力巨大和不涉及伦理问题这些优势外,MSCs还具有趋化特性。趋向受损部位的定向迁移已经成为MSCs临床应用研究的关键问题。骨桥蛋白(osteopontin, OPN)是一种细胞外基质蛋白,在不同的组织细胞中均有所发现。当机体各部位受到损伤时,损伤部位的OPN表达升高。OPN表达的升高不仅能增加多种细胞的迁移能力,同时也能介导细胞定向迁移。迄今为止,OPN在MSCs定向迁移过程中的作用还未引起研究者的足够重视,相关的研究还鲜见报道,其分子机理更不明了。因此,本文试图揭示外源OPN在大鼠MSCs(rat MSCs, rMSCs)定向迁移过程中的作用及其分子机理。该研究工作的主要内容及结果如下:1. rMSCs的原代分离培养及鉴定利用1.073 g/ml的Percoll密度梯度离心法和rMSCs贴壁特性,体外分离培养rMSCs。结果表明,原代细胞14天左右达到85%融合。传代后的细胞贴壁时间约为半小时。细胞24 h内即可完全伸展,呈纤维状。传代细胞增殖能力强,4~6天达到80%~90%融合,并形成漩涡样单层,细胞形态趋于一致。流式细胞仪检测发现,分离得到的细胞表达CD44和CD90,但不表达CD34,符合MSCs表面标记抗原的一般规律。2. OPN促rMSCs定向迁移Transwell迁移实验检测OPN是否能够诱导rMSCs定向迁移。结果表明,OPN具有促rMSCs定向迁移的能力,并且OPN促rMSCs定向迁移的能力与OPN的浓度呈现一定的剂量相关性。3. Integrinβ1介导OPN促rMSCs迁移为检测在迁移过程中,OPN是否能改变细胞CD44v6或integrinβ1 mRNA的表达,RT-PCR检测OPN(1μg/ml)作用rMSCs后,mRNA的表达变化情况。结果表明,OPN能使integrinβ1 mRNA的表达水平增加(1.5倍,p<0.01)。但CD44v6 mRNA的表达情况却没有明显改变。另外,western蛋白印迹表明,OPN作用2.0 h以后,integrinβ1的蛋白表达开始上升;4.0 h,达到峰值(1.3倍,p<0.05);6.0 h以后,integrinβ1的蛋白表达开始下调,但依旧高于对照组。阻断integrinβ1受体后,OPN促rMSCs定向迁移的能力受到抑制。提示,OPN能够增加rMSCs中integrinβ1的表达,同时通过结合细胞表面integrinβ1受体,促进rMSCs定向迁移。4.黏着斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)/胞外信号调节激酶(extracellular signalregulated kinase, ERK)信号通路介导OPN促rMSCs定向迁移Western蛋白印迹检测OPN(1μg/ml)作用rMSCs后,磷酸化FAK (phospho-FAK, pFAK)和磷酸化ERK1/2(phospho-ERK1/2, pERK1/2)的表达变化情况。结果表明,OPN作用条件下0.5 h, pFAK的表达量升高(1.3倍,p<0.05),FAK信号通路被激活;pERK1/2在OPN作用0.5 h时,表达升高(1.7倍,p<0.05),1.0 h,达到峰值(2.8倍,p<0.01),2.0 h有所回落(1.3倍,p<0.05),4.0 h后与对照组相比没差异。抑制剂阻断OPN激活ERK和FAK信号通路以后,OPN促rMSCs定向迁移的能力受到抑制。另外,integrinβ1抗体可有效抑制OPN升高pFAK和pERK1/2表达的作用,阻断FAK/ERK信号通路的激活。提示,OPN结合integrinβ1受体以后,通过激活FAK/ERK信号通路,促进rMSCs定向迁移。5. OPN改变rMSCs的力学性质原子力显微镜(atomic force microscope, AFM)检测OPN(1μg/ml)作用后,rMSCs杨氏模量的变化。结果发现,OPN可以显著降低rMSCs的杨氏模量(p<0.05)。另外,阻断integrinβ1受体,抑或阻断FAK/ERK信号分子的激活均能抑制OPN降低细胞杨氏模量的作用。结果表明,rMSCs的迁移能力与其细胞硬度密切相关。本文的研究结果表明,OPN可以通过上调integrinβ1的表达,激活FAK/ERK信号通路,降低rMSCs的细胞硬度,从而促进rMSCs定向迁移。结果提示,机体受损后,可能通过上调OPN的表达,诱导rMSCs定向迁移至受损部位,参与受损组织修复。