论文部分内容阅读
目的:应用生物信息学方法分析hsa-mi R-429的基本信息,预测其靶基因,对其靶基因进行功能注释,为探索其在卵巢癌治疗方面的机制研究作理论基础。方法:利用从mi RDB、Targetscan、Target Miner、RNACentral四个预测软件和Satrbase v3.0数据库平台预测到的hsa-mi R-429的靶基因,并通过GEO数据库检索到有关mi R-429靶基因的芯片数据库GSE56967进行靶基因分析,将预测到的靶基因进行GO功能注释。结果:四个预测软件同期预测到25个hsa-mi R-429的靶基因,在Satrbase v3.0数据库平台中预测出7个预测靶基因(ZEB1、ATP2A2、NAB1、VLDLR、CHD1、SEC23A、FRMD4B);在GEO数据库中搜索卵巢癌与mi R-429有关的数据芯片,结果显示,mi R-429过表达会介导ZEB1下调。而预测到的hsa-mi R-429的靶基因在胚胎器官发育、转录调控、MAPK家族信号通路的调控、信号调节、信号传导、脂质代谢等生物学过程具有富集表现(P<0.05)。结合前期研究中卵巢癌与mi RNA的差异表达谱相关的临床数据,发现mi R-429在卵巢癌耐药组中下调0.35倍,mi R-429及其靶基因ZEB2和KANK2的差异表达亦与患者OS和PFS相关。结论:hsa-mi R-429可能调控多种靶基因,而ZEB1、ATP2A2、NAB1、VLDLR、CHD1、SEC23A、FRMD4B可能是发挥关键作用的基因;同时在与卵巢癌相关方面,转录调控、MAPK家族信号通路的调控、信号调节、信号传导又可能是hsa-mi R-429靶基因群关键的调节机制所在,后续将同期对这些靶基因进行实验和临床的验证。目的:前期研究表明mi R-429的靶基因可能是ZEB1,以此探讨卵巢癌耐药细胞系及裸鼠移植瘤中ZEB1的表达水平。方法:慢病毒感染靶细胞;荧光定量PCR检测SKOV3、SKOV3/DDP2、SKOV3/DDP2-mi R-429mimics、SKOV3/DDP2-mi R-NC、SKOV3/DDP2-mi R-429inhibitor细胞中mi R-429的表达水平分析;将SKOV3、SKOV3/DDP2、SKOV3/DDP2-mi R-429mimics、SKOV3/DDP2-mi R-NC、SKOV3/DDP2-mi R-429inhibitor细胞移植入小鼠皮下,监测移植瘤的生长情况;q RT-PCR检测移植瘤组织的mi R-429表达;免疫组化观察裸鼠移植瘤ZEB1的表达;HE(苏木素-伊红)染色观察裸鼠移植瘤的细胞形态。结果:SKOV3/DDP2-mi R-429mimic移植瘤与对照组移植瘤相比,肿瘤生长速度缓慢;mi R-429在移植瘤SKOV3/DDP2-mi R-429m imics中呈高表达;免疫组化检测发现,五种移植瘤中ZEB1的表达随顺铂的注射次数的增加而减弱,且移植瘤SKOV3/DDP2-mi R-429mimics中ZEB1的表达程度低于对照组移植瘤。结论:在裸鼠移植瘤研究中,mi R-429可以靶向作用于ZEB1,mi R-429的上调对ZEB1基因的表达有抑制作用。目的:探索mi R-429过表达后在卵巢癌顺铂耐药株SKOV3/DDP2自噬过程的变化,以及对PI3K-AKT1自噬通路的影响,并采用裸鼠体内实验验证。方法:CCK8检测SKOV3/DDP2和亲本细胞SKOV3的IC50及SKOV3/DDP2的耐药指数;CCK8检测SKOV3/DDP2、SKOV3/DDP2-mi R-429mi mics、SKOV3/DDP2-mi R-NC、SKOV3/DDP2-mi R-429inhibitor细胞的IC50值;免疫荧光观察不同浓度顺铂作用24小时细胞内自噬蛋白LC3A/B分布的影响;透射电镜观察一定顺铂浓度作用24小时细胞内的自噬小体;West ern Bolt检测不同顺铂浓度作用24小时细胞内自噬蛋白(LC3A/B-II)/(LC3A/B-I)、p62的表达;Western Bolt检测mi R-429过表达影响卵巢癌细胞中PI3K-AKT1通路的表达;Western Bolt检测移植瘤内自噬蛋白(LC3A/B-II)/(LC3A/B-I)、p62的表达;HE(苏木素-伊红)染色观察裸鼠移植瘤;免疫组化观察裸鼠移植瘤中LC3B的表达。结果:顺铂诱导后,mi R-429过表达耐药株mimics透射电镜未见自噬体形成;一定浓度顺铂作用后,Western Bolt显示mimics细胞(LC3A/B-II)/(LC3A/B-I)比值降低,p62升高;SKOV3/DDP2-mi R-429mimics在PI3K-AKT1自噬通路中AKT1、p-AKT1、m TOR、p-m TOR的表达增高,同时,SKOV3/DDP2-mi R-429inhibitor中Atg7和AM PK的表达上调。裸鼠体内实验中,Western Bolt检测SKOV3/DDP2-mi R-429mimics裸鼠瘤的LC3A/B的表达比对照组低。结论:mi R-429过表达能在SKOV3/DDP2细胞中减弱顺铂诱导产生的自噬,同时增加顺铂耐药细胞的敏感性,并且mi R-429在卵巢癌耐药细胞中过表达能有效的抑制耐药肿瘤生长,减弱顺铂诱导的自噬。因此,进一步研究mi R-429介导自噬对卵巢癌耐药发展过程中的信号传导通路机制研究及其在临床中的应用提供了重要的指导意义。