骨关节炎(Osteoarthritis, OA)是一种以关节软骨破坏、骨赘形成、软骨下骨硬化以及滑膜改变为特征的慢性关节疾病,好发于中年以后。它的发生与年龄、性别、创伤和肥胖等多种因素相关。越来越多的研究表明,肥胖可以触发炎症反应,以往认为脂肪组织作为人体的储能组织存在,而近年来其作为一个具有内分泌功能的器官越来越受到研究者的关注。肥胖相关代谢因子,尤其是脂肪组织分泌的各种脂肪因子(Adipokines),可以通过诱导前炎症因子以及降解酶类的表达而导致软骨基质降解及软骨下骨重构,从而在关节炎的发生发展中起到重要作用。通过研究具体脂肪因子在OA中的作用和相关机制,能够进一步了解OA的疾病进展过程和发现相应的治疗靶点,从而为临床预防治疗OA提供新的思路。研究发现多数脂肪因子在肥胖病人的关节液(Synovial fluid, SF)中浓度显著升高,并与OA严重程度及关节疼痛呈正相关,而且能够促进炎症因子和降解因子的表达,如白介素1β(Interleukin-1 beta, IL-1β),基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases, MMPs),以及带有血小板凝血酶敏感蛋白样模体的解整链蛋白金属蛋白酶(A disintegrin and metalloprotease with thrombospondin motifs, ADAMTS)等,从而降解关节软骨基质,在OA病程中扮演了促炎促降解的作用。然而,新近发现的另外一种脂肪因子,内脏脂肪组织来源的丝氨酸蛋白酶抑制剂(Visceral adipose tissue-derived serine protease inhibitor, Vaspin),在许多方面却表现出与同家族其他脂肪因子之间截然相反的抗炎特性。有研究者发现vaspin能够抑制血管平滑肌的细胞凋亡和炎症反应,在体外培养的破骨细胞中vaspin可以下调MMP-9和cathepsin K等炎症降解因子的表达,在大鼠脂肪组织中vaspin还能够抑制促炎因子resistin, leptin和(Tumor necrosis factor-α, TNF-α)的表达而发挥抗炎作用。关于同家族的vaspin为什么会表现出与其他脂肪因子相反的特性至今尚无文献报道。在本次研究中,我们探讨了新型脂肪因子vaspin在OA中的作用及可能涉及的作用机制。本次研究主要分成四部分：一、首先研究vaspin在正常人群和OA人群中的表达特性,分析vaspin表达与OA疾病的相关性。我们的研究发现在OA患者膝关节内组织均有vaspin的基因表达,且在关节组织退变严重区域vaspin表达更明显；重要的是,OA患者血清内vaspin含量较正常人群显著减少,表明vaspin与OA疾病密切相关。二、使用不同浓度及作用时间的重组vaspin处理体外培养的正常及炎性软骨细胞,探索vaspin对软骨细胞中MMPs, ADAMTS,环氧化酶-2(Cyclooxygenase-2, COX-2),前列腺素E2(Prostaglandin E2, PGE2)和诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)等因子表达的影响。我们的研究发现vaspin能够拮抗IL-1p介导的软骨细胞炎症和降解作用,降低炎症及降解酶类因子的表达。三、在体外培养的软骨细胞中,观察vaspin拮抗IL-1p介导的炎症降解作用的具体分子机制。结果发现vaspin拮抗IL-1p介导的炎症降解作用是部分通过抑制NF-κB信号通路实现。四、在体内大鼠膝关节腔注射模型中,观察了vaspin对关节软骨的作用。结果发现vaspin可以减轻IL-1p引I起的降解酶因子表达和关节软骨损伤。我们的研究结果表明,vaspin具有保护软骨抗骨性关节炎作用。Vaspin在正常人群和OA人群中的表达特性目的：观察vaspin在膝关节内组织的表达情况；观察vaspin在正常人群和OA人群中的表达差异。方法：取膝关节OA患者全膝关节置换术(Total knee arthroplasty, TKA)后的膝关节软骨、滑膜、半月板、脂肪垫和骨赘等标本,用实时定量聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction, PCR)法检测各组织中vaspin的基因表达,用免疫组织化学方法(Immunohistochemistry, IHC)检测关节软骨、滑膜和骨赘中vaspin的蛋白表达和分布。用酶联免疫吸附检验法(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)观察23例正常人群和26例OA人群血清中vaspin的含量差异。结果：膝关节内关节软骨、滑膜、半月板、脂肪垫和骨赘等组织中均检测出vaspin基因表达。在软骨退变严重,滑膜增生明显以及骨赘形成区域vaspin表达更加明显。OA患者血清vaspin水平较正常人群显著下降(18.5±11.1 pg/mL vs 26.3+9.6pg/mL,p=0.01)。结论：Vaspin在关节内各组织中均有表达,在退变严重区域表达丰富,OA人群血清vaspin水平较正常人群显著下降,提示vaspin与OA疾病的发生发展存在密切关联。第二部分Vaspin对培养软骨细胞具有抗炎抗降解作用目的：观察vaspin对体外培养的大鼠关节软骨细胞的毒性作用；观察vaspin拮抗IL-1p介导的软骨细胞炎症降解作用。方法：取4周龄(Sprague-Dawley, SD)大鼠膝关节软骨细胞体外分离培养后传至3代稳定。用不同浓度的vaspin(10-500ng/m1)处理软骨细胞24和48小时,用细胞计数活性法(Cell counting kit-8,CCK-8)检测软骨细胞的分化活性；用不同浓度vaspin干预IL-1β刺激的软骨细胞,用时定量PCR法检测细胞内MMP-2,MMP-9,ADAMTS-4和ADAMTS-5的基因表达变化,用ELISA法检测细胞培养上清液中COX-2,PGE2和iNOS的含量变化。结果：Vaspin在浓度到达500ng/ml时不会对软骨细胞产生毒性作用。Vaspin抑制IL-1p介导的体外培养关节软骨细胞MMP-2,MMP-9和ADAMTS-5的基因表达,同时也减少细胞上清液中COX-2,PGE2和iNOS的含量。结论：Vaspin在浓度达500ng/ml时对软骨细胞无毒性作用；vaspin对体外培养的关节软骨细胞具有抗炎症抗降解作用。第三部分Vaspin拮抗IL-1p介导的软骨细胞炎症降解作用的分子机制研究目的：观察vaspin拮抗IL-1β介导软骨细胞炎症降解作用的分子机制。方法：取4周龄SD大鼠膝关节软骨细胞体外分离培养后传至3代稳定。用10ng/ml的IL-1β预处理1小时后,加入不同浓度vaspin 24小时,使用Western blot检测软骨细胞中磷酸化核转录因子(p-nuclear factor kappa B, p-NF-κB)和转录抑制因子(Inhibitor of nuclear factor kappa B, IκBα)的表达。在软骨细胞中加入NF-κB信号通路抑制剂BAY11-7082(1μM)预处理l小时,再加入IL-1β10ng/ml培育24小时,用ELISA法检测细胞上清液中COX-2,PGE2和iNOS的含量变化。结果：Vaspin显著抑制了软骨细胞中IL-1β介导的NF-κB的磷酸化和IκBα的降解。NF-κB信号通路抑制剂BAY11-7082显著降低了IL-1β介导的软骨细胞上清液中COX-2,PGE2和iNOS的含量。结论：Vaspin可以通过抑制NF-κB信号通路拮抗IL-1p介导的软骨细胞炎症降解作用。第四部分Vaspin拮抗IL-1β介导动物关节腔内软骨降解作用的观察目的：观察vaspin拮抗IL-1p介导动物关节腔内软骨降解作用。方法：取40只3月龄雄性SD大鼠(250g),用膝关节腔内注射动物模型。随机分为4组,每组10只,分别为正常对照组,50μgIL-1p组,50μg vaspin组和50μgIL-1p+50μg vaspin组,正常组不行关节腔注射,其余各组动物注射药物48小时后处死,取膝关节(胫骨侧)标本,用实时定量PCR法检测关节软骨中MMP-2,MMP-9,ADAMTS-4和ADAMTS-5的基因表达,并使用番红-固绿染色观察软骨内蛋白多糖(Proteoglycan, PG)的含量变化。结果：Vaspin显著抑制关节软骨中IL-1p介导的MMP-2,MMP-9和ADAMTS-5基因表达。Vaspin对关节软骨内蛋白聚糖含量无显著影响,IL-1β组导致软骨表浅层至下层的全层蛋白聚糖丢失,而vaspin能够抑制IL-1p介导的关节软骨中下层蛋白聚糖丢失。结论：Vaspin在体内可拮抗IL-1p介导的关节软骨降解退变,为骨性关节炎的预防和治疗提供新的思路和途径。