【摘 要】
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骨骼肌在维持身体正常机能中发挥重要作用,骨骼肌的生长发育过程可以由成肌细胞的成肌发育过程阐明。C2C12细胞作为成肌细胞功能研究的经典模型被广泛用于科学研究中。mi RNA是一种长度为20bp左右的短链非编码RNA,通过靶向调控m RNA的表达,在转录水平和转录后水平参与多种生命过程的调控。mi RNA在成肌细胞增殖、迁移和分化过程中同样发挥重要的功能,研究mi RNA功能对于阐明成肌细胞的发育过
【基金项目】
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广东省农业厅（2017LM2148）； 广东省教育厅（2017KZDXM009）；
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骨骼肌在维持身体正常机能中发挥重要作用,骨骼肌的生长发育过程可以由成肌细胞的成肌发育过程阐明。C2C12细胞作为成肌细胞功能研究的经典模型被广泛用于科学研究中。mi RNA是一种长度为20bp左右的短链非编码RNA,通过靶向调控m RNA的表达,在转录水平和转录后水平参与多种生命过程的调控。mi RNA在成肌细胞增殖、迁移和分化过程中同样发挥重要的功能,研究mi RNA功能对于阐明成肌细胞的发育过程,完善其调控机理,进一步了解肌肉发育过程具有重要的意义。本研究以C2C12细胞为模型,通过过表达和干扰mi R-92b-3p研究其对C2C12细胞增殖、迁移和分化的影响。并通过生物信息学预测和双荧光素酶报告系统检测得知,其在增殖期可能通过调控Sgk3表达来发挥功能,通过构建Sgk3过表达载体和合成干扰片段,研究Sgk3对C2C12细胞增殖的影响。获得主要研究结果如下:1)mi R-92b-3p抑制C2C12细胞增殖C2C12细胞过表达和干扰mi R-92b-3p后24 h和48 h,通过流式细胞技术检测发现过表达后G1期的细胞数量显著增加,S期细胞数量显著降低。定量检测细胞周期蛋白和p21表达,结果显示过表达24 h后Ccna、Ccnb表达量显著降低,p21表达量显著增加,48 h后Ccnb表达量显著降低,干扰后结果相反。蛋白水平检测结果与m RNA水平结果一致。2)mi R-92b-3p抑制C2C12细胞迁移过表达和干扰mi R-92b-3p后24 h,进行划痕试验,通过活细胞工作站观察发现,迁移6 h,过表达mi R-92b-3p后迁移距离极显著降低,12 h显著降低,干扰后有相反的结果。定量检测迁移相关基因表达发现过表达mi R-92b-3p后Mmp2的表达量显著降低,干扰后结果相反。表明mi R-92b-3p可能是通过影响Mmp2的表达,抑制C2C12细胞迁移。3)mi R-92b-3p对C2C12细胞分化无影响C2C12细胞过表达mi R-92b-3p后诱导分化3、5、7、9天,通过Myosin免疫荧光发现,过表达mi R-92b-3p后Myosin阳性率无显著变化。定量检测Myosin和Myogenin的表达发现过表达mi R-92b-3p后其表达量也无显著变化。表明mi R-92b-3p对C2C12细胞分化无影响。4)靶基因预测通过生物信息学分析及双荧光素酶报告系统分析检测发现mi R-92b-3p可抑制包含Sgk3野生型3’UTR区的pmir GLO载体荧光素酶活性;在C2C12细胞中,过表达mi R-92b-3p后可降低Sgk3在m RNA水平和蛋白水平的表达,干扰后结果相反。表明Sgk3是mi R-92b-3p潜在的靶基因。5)Sgk3促进C2C12细胞增殖通过构建pc DNA3.1-Sgk3过表达载体和合成干扰片段,在增殖期24 h和48 h进行流式细胞技术检测,结果显示,过表达Sgk3后24和48h位于G1期细胞数量显著降低,S期细胞数量显著增加,干扰后有相反的结果。定量检测细胞周期蛋白和p21表达发现,过表达Sgk3后24 h Ccnb表达量显著增加,48 h后Ccnb、Ccnd表达量显著增加。干扰后24 h Ccna、Ccnb表达量显著降低,48 h后Ccnb表达量显著降低,p21表达量显著增加。在蛋白水平与m RNA水平趋势一致。表明Sgk3可能通过促进G1期向S期的转换,促进C2C12细胞的增殖。6)mi R-92b-3p通过靶向Sgk3调控细胞增殖pc DNA3.1+NC、pc DNA3.1+mimics、pc DNA3.1-Sgk3+NC、pc DNA3.1-Sgk3+mimics分别转染C2C12细胞,研究mi R-92b-3p与Sgk3的相互作用,通过流式细胞周期检测、定量和WB检测发现mi R-92b-3p可以降低Sgk3促进C2C12细胞增殖的效果。综上所述,mi R-92b-3p可以通过靶向Sgk3抑制C2C12细胞增殖,可能通过抑制Mmp2表达抑制C2C12细胞迁移。
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