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1研究背景与研究目的肾母细胞瘤,这种儿童肾脏疾病,属于腹部恶性实体肿瘤之一,一般在婴幼儿体内发生,治疗后生存率的提高依赖于早期诊断以及合适的综合治疗。当前,这种儿科疾病诊断检查方法以彩色多普勒超声、静脉尿路造影、CT和MRI为主,预后监测的方法以彩色多普勒超声和CT为主,以上检查方法的结果敏感性不高,能够早期诊断肾母细胞瘤的措施不够完善。以根治性手术切除为主的综合治疗是此儿科疾病的主流治疗措施,当然,合理的放化疗是其必要组成部分。早期的肾母细胞瘤疾病的治愈效果基本令人满意,但进入中晚期之后,肾母细胞瘤的治疗效果亟待提高。鉴于肾母细胞瘤的早期诊断、临床病理分期和预后监测对于肾母细胞瘤的治疗至关重要,要求一种更敏感的、更准确的诊断和监测的方法。长期以来对于肾母细胞瘤的治疗主要依靠根治性肾切除术,现在以手术为主,辅助化疗或放疗,I、II期的长期生存率达到90%,III、IV期的长期生存率达到70-80%。尽管肾母细胞瘤患儿经过手术、化疗、放疗等临床治疗后,可以得到一个较高程度的长期生存率,但这些治疗措施后会出现心力衰竭、生殖功能异常、肾功能异常等各种不同程度的临床并发症,甚至在儿童成年后亦会出现严重的并发症。因此,需要研发一种以减少治疗负担和改善治疗结果为主要目标的新颖的治疗肾母细胞瘤方式。本课题包含两部分内容。第一部分,依赖蛋白质组学的技术与方法,寻找出肾母细胞瘤特异性蛋白质标记物M/Z 6455.5Da蛋白质多肽,进一步拓展建立以此为基础的分期诊断模型和预后监测模型;第二部分,人工合成M/Z 6455.5Da蛋白质多肽,通过体内、体外实验,研究其对肾母细胞瘤的生物学行为的影响,在基因水平上,探索M/Z 6455.5Da蛋白质多肽对肾母细胞瘤的作用机制。2材料与方法2.1实验材料2.1.1临床病例资料肾母细胞瘤m/z 6455.5Da蛋白质多肽的筛选。选取肾母细胞瘤患儿48例,入院检查时抽取血清作为肿瘤组;选取年龄、性别与之相当的正常健康儿童54例,常规体检时抽取血清作为正常组肾母细胞瘤m/z 6455.5Da蛋白质多肽分期诊断模型的构建。选取肾母细胞瘤患儿94例,入院检查时抽取血清作为肿瘤组;选取年龄、性别与之相当的正常健康儿童41例,常规体检时抽取血清作为正常组。依据NWTS-5分期,肿瘤组中包含I期23例,II期30例,III期26例和IV期15例,进一步将肿瘤组分为WT-I组,WT-II组,WT-III组和WT-IV组。肾母细胞瘤血清标记物预后监测模型的构建。正常健康儿童血清30例作为正常组,血清样本为体检检查时抽取。肾母细胞瘤患儿40名,此40名肾母细胞瘤患儿中:根治切除瘤体,完全治愈者27名;另外13名肾母细胞瘤患儿,手术治疗和（或）术后治疗效果差。分四次抽取肾母细胞瘤患儿160例血清样本,抽取时间为术前、术后2周、术后2月和术后6月。根据治愈情况,将肾母细胞瘤患儿血清标本进一步分为:术前组40例,治愈组（术后2周）27例,治愈组（术后2月）27例,治愈组（术后6月）27例,未治愈组（术后2周）13例,未治愈组（术后2月）13例,未治愈组（术后6月）13例。所有血清样本均来自河南省郑州大学第一附属医院小儿外科,采集时间2007年1月至2013年12月。以上肾母细胞瘤病例中所有患儿均未行术前化疗,其病理诊断结果均为良好组织学类型,病理样本的诊断均由两位以上的病理学专家检测病理切片后论证。经郑州大学伦理委员会、郑州大学第一附属医院伦理委员会认证批准,所有受试者法定监护人签署有知情同意书。2.1.2人工合成m/z 6455.5Da蛋白质多肽在Life Tein’s Peptide SynTM technology平台,通过FOMC-保护氨基酸固相合成法合成m/z 6455.5Da蛋白质多肽,具体工业生产过程交由Life Tein LLC完成。合成后的m/z 6455.5Da蛋白质多肽的形式为包含55个氨基酸的单链化合物,样品纯度为96.57%。常温下,将m/z 6455.5Da蛋白质多肽溶解在生理盐水中,配制成1μmol/ml药物原液,在-20℃环境下避光保存。2.1.3建立SK-NEP-1细胞系并成瘤裸鼠选择肾母细胞瘤细胞株SK-NEP-1作为研究对象,购自ATCC。建立好的SK-NEP-1细胞系为悬浮半贴壁型,换液间隔时间为3天,传代间隔时间为9天。选择4周龄雌性BALB/c Nude近交系无胸腺小鼠作为研究对象,在标准化SPF级动物实验室内饲养,建立稳定的12小时黑12小时白昼夜更替环境。所有操作均在无菌环境下进行。培养SK-NEP-1细胞,在指数生长期内提取该细胞,重悬浮于血清培养基和BD Matrigel基质胶中,两者比例为1:1,调整SK-NEP-1细胞浓度为1×107个/0.2ml。消毒裸鼠皮肤后,向左侧前肢腋窝皮下接种0.2ml细胞混合液,每3天观测一次,持续2周,建立肾母细胞瘤荷瘤小鼠模型。肾母细胞瘤荷瘤小鼠模型建立完成后,将其划分为实验组与对照组:实验组每天08:00AM时,经由腹腔向荷瘤小鼠注射m/z 6455.5Da蛋白质多肽稀释液,注射剂量为4mg/kg;对照组每天08:00AM时,向荷瘤小鼠模型腹腔注射相应体积的生理盐水。本部分的研究,经郑州大学伦理委员会、郑州大学第一附属医院伦理委员会认证批准。2.1.4主要仪器与试剂Profiling Kit 100 MB-WCX和MALDI-TOF-MS购自于德国Bruker公司;Protein Chip、PBS II+SELDI-TOF-MS、Bio-processor、WCX2 Protein Chip购自于美国Ciphergen Biosystems公司;SPD Speed Vac、2D-LC-LTQ-MS、Thermo酶标仪购自于美国Thermo公司;HPLC购自于日本岛津公司;Applied Biosystems7500 Fast Real-Time PCR System购自于美国ABI公司;BD Influx流式细胞仪购自于美国BD公司。乙腈、尿素等主要蛋白质组学实验试剂购自于美国Sigma公司;细胞培养相关试剂购自于美国Gibco公司;MB-WCX试剂盒购自于德国Bruker公司;PCR和Western blot相关实验试购自于美国Thermo公司。2.2实验方法2.2.1蛋白质组学筛选血清差异性蛋白质血清样解冻完毕后离心取上清液备用。使用弱阳离子试剂盒,按照说明与要求预处理血清样本,处理完毕后,静置供质谱分析。对WCX2 Protein Chip进行预处理,将预处理好的血清样本和U9稀释液充分混匀后,加入WCX2 Protein Chip的孔中。震荡WCX2 Protein Chip,使待测样本与WCX2 Protein Chip充分作用,弃除液体,使用超纯水、SPA溶液清洗结合有待测样本的芯片。干燥后,将其插入工作支架Bio-processor中,记录芯片坐标,准备上机使用。设置好PBS II+SELDI-TOF-MS的参数,将工作支架Bio-processor,装入SELDI-TOF-MS中进行检测,对血清差异性蛋白质进行筛选。采用Ciphergen Biosystems软件3.1版本原始数据进行校正,得到样本中各个m/z及其对应的蛋白质峰值数据,采用ZUCIPDAS网络服务软件分析蛋白质芯片数据。对SELDI-TOF-MS数据进行Wilcoxon秩和检验,P值小于0.01;对各组的SELDI-TOF-MS数据进行t检验,α值等于0.01。分析不同组别之间的数值,从中得到m/z相同、m/z对应的峰值不同的差异性蛋白质,再经过SVM筛选出youden指数最高的组合模型。根据SELDI-TOF-MS筛选结果,选取目标蛋白质表达量较高的血清样本作为分离纯化对象。预处理血清样本后,采用C18反相高压液相色谱柱对其进行分离。分别收集各峰组分,并转入SPD Speed Vac,真空浓缩体积,保存备用。提取纯化后的各组分样本和WCX2 Protein Chip进行预处理,预处理后置入MALDI-TOF-MS进行蛋白质质荷比的检测,找出与前期SELDI-TOF-MS技术筛选的目标蛋白质所在的样本。取纯化后的目标蛋白质进行酶解反应,酶解完成后真空浓缩体积,加入到C18蛋白质样品检测的梯度洗脱柱与2D-LC-LTQ-MS系统的喷雾系统串联,进行肽质荷比图谱的检测得到目标蛋白质的PMFs。最后,将目标蛋白质的肽质量指纹图（PMFs）数据导入SEQUEST程序中,调整系数,搜索Bioworks数据库,经数据库软件计算得到目标蛋白质的氨基酸序列。2.2.3体外细胞学实验选择处于对数生长期的SK-NEP-1细胞接种到24孔培养板,接种1天后,进行细胞计数,作为初始细胞数量。将m/z 6455.5Da蛋白质多肽药物原液加入到24孔培养板中,使每孔终浓度分别为0、1×10-6、1×10-5、1×10-4、1×10-3、1×10-2μmol/ml。以24h为时间间隔,取各组3个复孔的SK-NEP-1细胞进行计数,持续一周,绘制出细胞生长曲线,并计算得到SK-NEP-1细胞的倍增时间。处于对数生长期的SK-NEP-1细胞接种到96孔培养板,接种1天后,将m/z 6455.5Da蛋白质多肽药物原液加入到96孔培养板中,使每孔终浓度分别为0、5、10、15、20、25、30×10-3μmol/m L。24h、48h和72h后,使用酶标仪检测吸光度OD值,计算细胞活性,绘制出细胞毒性作用的校正曲线,并计算m/z 6455.5Da蛋白质多肽在SK-NEP-1细胞系中的24h、48h和72h半数抑制浓度（IC50）和80%抑制浓度（IC80）。选择处于对数生长期的SK-NEP-1细胞,接种到6孔培养板,接种密度为1×106个/孔。接种1天后,将m/z 6455.5Da蛋白质多肽药物原液,加入到6孔培养板内,使每孔终浓度分别为0、IC50（48h半数抑制浓度）和IC80（48h 80%抑制浓度）。2天后,收集空白组、IC50组和IC80组的细胞,使用流式细胞仪,分析凋亡的SK-NEP-1细胞百分比和SK-NEP-1细胞的生长周期选择处于对数生长期的SK-NEP-1细胞,按细胞浓度1×106个/m L接种到2个25cm2培养瓶中。接种1天后,将m/z 6455.5Da蛋白质多肽加入一个培养瓶,使终浓度为IC50,作为实验组;另一瓶作为空白组。48h后,收集空白组与实验组中的细胞提取总RNA后,应用试剂盒逆转录c DNA。然后在Real-time PCR过程中检测空白组和实验组中的待测基因的扩增情况,并使用软件分析PCR数据。选择处于对数生长期的SK-NEP-1细胞,按细胞浓度为1×106个/m L接种到2个75cm2培养瓶中。接种1天后,将m/z 6455.5Da蛋白质多肽加入一个培养瓶,使终浓度为IC50,作为实验组;另一瓶作为空白组。48h后,收集各组瓶内细胞,提取总蛋白,测定蛋白质浓度。制备蛋白质电泳SDS-PAGE胶,将待测蛋白质样品上样进行电泳分离,然后蛋白质印迹转膜。在PVDF膜上孵育抗体,检测PVDF膜,照相分析结果。2.2.5裸鼠模型体内实验选择处于对数生长期的SK-NEP-1细胞,调整细胞浓度为1×107个/0.2m L,接种到裸鼠体内,建立肾母细胞瘤荷瘤小鼠模型。实验组每天经腹腔向裸鼠体内注射m/z 6455.5Da蛋白质多肽,注射剂量为4mg/kg,每日一次,持续6周。对照组注射相应体积的生理盐水。记录荷瘤小鼠体表肿瘤的生长情况,每隔3天,测量体表肿瘤的直径和体积。6周后,颈椎脱臼法处死,解剖瘤体,测量、拍照、记录。解剖对照组与实验组的裸鼠后,石蜡包埋肿瘤组织,切成4um的切片。做免疫组化分析和TUNEL凋亡检测3结果3.1蛋白质组学实验结果儿童肾母细胞瘤患儿血清中,高表达的蛋白质峰值有3个,相反,低表达的9个,经过支持向量机技术（SVM）筛选出约登指数最高的模型,得到m/z6455.5Da的蛋白标记物。该标记物在肿瘤组中低表达,表达强度为881.68±484.86;在正常组高表达,表达强度为3503.27±780.49,差异有统计学意义。在肾母细胞瘤分期诊断模型实验中,分析正常组、肿瘤组、WT-I组、WT-II组、WT-III组和WT-IV组m/z 6455.5Da蛋白标记物的表达量,分别为3305.50±821.90、1279.50±919.17、2579.95±644.57、1116.63±504.98、911.70±294.15、248.76±228.21。对正常组、WT-I组、WT-II组、WT-III组和WT-IV组进行统计学对比,任意两组数据之间差异有统计学意义。确定了M/Z 6455.5Da蛋白质多肽可以作为肾母细胞瘤分期模型的标准。在肾母细胞瘤预后监测模型实验中,分析m/z 6455.5Da蛋白标记物的表达量。正常组表达强度为3619.27±760.79,术前组表达强度为881.36±355.29,差异有统计学意义。术后治愈组为2198.35±741.09（术后2周）、2604.43±886.20（术后2月）、3246.36±859.22（术后6月）;术后未治愈组为863.05±250.79（术后2周）、743.47±375.99（术后2月）、480.72±250.04（术后6月）。m/z6455.5Da蛋白标记物的表达在手术治愈后检测时升高,其中各时期的数据与术前组均有统计学差异,与正常组相比无差异;m/z 6455.5Da蛋白标记物的表达在治疗（包括手术、术后放化疗）失败后检测时降低,其中各时期的数据与与正常组均有统计学差异,与术前组无差异。肾母细胞瘤患儿经过完整手术切除瘤体以及相应的术后化疗完全治愈后,该蛋白质标记物的表达再次升高,并随着术后的恢复逐渐上升到与正常健康儿童的水平相当;姑息性切除肾母细胞瘤患儿的瘤体或者完整切除但术后复发转移的情况中,该蛋白质标记物持续低表达。分离纯化m/z 6455.5Da蛋白质多肽,MALDI-TOF-MS验证其准确无误后,通过2D-LC-LTQ-MS系统检测目标蛋白质,分析获得各种蛋白质片段的氨基酸序列,将这些蛋白质片段的氨基酸序列导入SEQUEST程序并在Bioworks数据库检索,进行匹配重组,获得完整的氨基酸序列。收集正常健康儿童、肾母细胞瘤患儿、其他腹部实体肿瘤患儿的血清样本、影像学检查和预后生存资料,分析m/z 6455.5Da蛋白质多肽的敏感性与特异性。m/z 6455.5Da蛋白质多肽在分期诊断的敏感性上较其它诊断方法具有明显的优势,m/z 6455.5Da蛋白质多肽在预后监测的敏感性与特异性上较其它诊断方法均具有明显的优势。3.2体外细胞实验结果观察组中m/z 6455.5Da蛋白质多肽干预的SK-NEP-1细胞生长趋势,较未受药物干预的对照组的正常的SK-NEP-1细胞差,并呈剂量依赖性特点。根据所绘制的细胞生长曲线,通过帕特森公式,计算得到SK-NEP-1细胞的细胞倍增时间。对照组中SK-NEP-1细胞在进入对数生长期24h后数量达到7.551×105个,细胞倍增时间为21.88小时;浓度为1×10-2μmol/ml的m/z 6455.5Da蛋白质多肽干预的SK-NEP-1细胞,在进入对数生长期24h后数量仅达到1.434×105个,倍增时间延长至67.40小时。根据观察组和对照组吸光度OD值,绘制出细胞毒性抑制率曲线,得到m/z 6455.5Da蛋白质多肽对SK-NEP-1细胞的毒性作用,数据表明m/z 6455.5Da蛋白质多肽阻滞了SK-NEP-1细胞的生长,并呈剂量依赖性和时间依赖性特点。通过流式细胞仪分析细胞凋亡比例,结果显示,m/z 6455.5Da蛋白质多肽干预SK-NEP-1细胞48小时后,空白组、IC50组和IC80组的细胞早期凋亡率分别为8.4%、22.3%和69.6%。在本研究中,我们发现m/z 6455.5Da蛋白质多肽能够有效的抑制SK-NEP-1细胞的增殖。通过流式细胞仪检测分析细胞生长周期,结果显示,m/z 6455.5Da蛋白质多肽干预了SK-NEP-1细胞,生长周期中G2/M期比空白组的SK-NEP-1细胞延长,m/z 6455.5Da蛋白质多肽诱导了SK-NEP-1细胞G2/M期的阻滞。在Real-time PCR过程中检测PCNA、Bcl-2和Bax的扩增表达情况,结果表明:m/z 6455.5Da蛋白质多肽干预了SK-NEP-1细胞后,下调了PCNA、Bcl-2的表达,同时上调了Bax的表达,验证了m/z 6455.5Da蛋白质多肽抑制SK-NEP-1细胞增殖的作用。同时对Wnt Pathway,Hedgehog Pathway,TGF-βPathway和Growth factor recepator Pathway这四条信号通路的关键蛋白进行检测,结果表明:m/z 6455.5Da蛋白质多肽干预了SK-NEP-1细胞后,下调了β-catenin的表达。m/z 6455.5Da蛋白质多肽抑制SK-NEP-1细胞增殖的过程中,β-catenin/Wnt Pathway发挥了重要的作用。Western blotting试验验证了PCNA、Bcl-2、Bax和β-catenin蛋白的蛋白质的表达情况,与PCR结果一致。3.3裸鼠模型体内实验结果m/z 6455.5Da蛋白质多肽干预的肿瘤组的肿瘤体积和直径,相比对照组缩小,m/z 6455.5Da蛋白质多肽在裸鼠体内具有明显的抗肾母细胞瘤作用。HE染色切片显示,对照组中肿瘤组织生长良好,观察组中肿瘤组织出现大片坏死,肿瘤组织结构受到破坏;TUNEL染色后,分别在荧光显微镜下观察,治疗组肿瘤细胞出现大片凋亡。免疫组化检测果显示,经过m/z 6455.5Da蛋白质多肽治疗后,肿瘤组织中PCNA低表达、β-catenin低表达、Bcl-2低表达,Bax高表达4结论m/z 6455.5Da蛋白质多肽是从人血清中分离出来的肾母细胞瘤特异性标记物,是由55个氨基酸组成的长肽,可以作为肾母细胞瘤分期诊断模型和预后监测模型的生物学标记物。同时,m/z 6455.5Da蛋白质多肽在分期诊断的敏感性上较其它诊断方法具有明显的优势,在预后监测的敏感性与特异性上较其它诊断方法均具有明显的优势。m/z 6455.5Da蛋白质多肽可以为肾母细胞瘤疾病的分期诊断与预后监测提供一种新的实验诊断方法。m/z 6455.5Da蛋白质多肽是一种能够有效诱导肾母细胞瘤细胞凋亡、抑制肾母细胞瘤组织生长的肿瘤抑制肽。初步探索m/z 6455.5Da蛋白质多肽抗肾母细胞瘤的作用机制,可能是m/z 6455.5Da蛋白质多肽调控了肾母细胞瘤细胞Wnt信号通路,导致其中关键蛋白β-catenin的表达下调,从而导致一些列复杂的细胞生物学变化。这种新的发现在研究肾母细胞瘤的治疗新方法、新手段方面潜在着重大意义,可能催生一种新型的抗肾母细胞瘤的蛋白质多肽药物的问世。