香雪兰(Freesia hybrida)是鸢尾科香雪兰属多年生球根草本花卉。目前,市场上常见的栽培种都是源于两个花色表型单一的野生种经杂交后代之间多次杂交、回交和基因组加倍的结果。现代栽培种香雪兰颜色跨度广,有白、红、黄、粉、紫和嵌合色等。此外,香雪兰花朵具有丰富的着色模式,花瓣、雌蕊和花丝都可着色,而且花瓣还有呈现出有色条纹。因此,香雪兰是研究单子叶植物类黄酮代谢尤其是花色苷代谢的良好材料。通过对植物进化过程的研究发现,花色苷等类黄酮物质的出现为植物适应复杂多变的陆地环境提供了重要保障。大量研究证明,花色苷合成的转录机制一般由来自MYB,bHLH和WD40家族转录因子形成的MBW三元复合物进行严格的时间和空间调控。但是,在以单子叶植物玉米和双子叶植物拟南芥为代表的物种中,花色苷合成的转录调控机制存在明显的差异。虽然,MBW复合物对花色苷合成的转录调控机制被广泛研究,但是,大多集中于双子叶植物的个别物种中。而对揭示进化过程中MBW复合物功能多样性有重要作用的单子叶植物却研究较少。本论文以香雪兰Red River~?为材料,首次对调控其花色苷合成的MYB和WD40转录因子进行了详细而系统的研究,并对香雪兰MBW复合物转录因子之间蛋白互作和调控网络进行解析。在此基础上,首次提出了香雪兰花朵花色苷合成的分层和反馈调控网络。结果不仅有利于我们理解单子叶植物花朵花色苷的转录调控机制,也为研究单子叶和双子叶植物进化过程中的花色苷转录调控机制之间的差异奠定基础,此外,所获得的有功能的调控花色苷合成相关转录因子基因还可以直接用于经济作物品质改良,具有重要的应用价值。主要研究方法及具体实验结果如下:1.正向调控香雪兰花色苷合成的MYB转录因子基因的克隆和鉴定利用香雪兰Red River~?盛开时期花朵转录组数据进行本地和NCBI在线BLAST,结果筛选并克隆得到香雪兰Red River~?花朵中两条可能正向调控其花色苷合成的R2R3-MYB转录因子FhPAP1L1和FhPAP1L2。生物信息学分析发现其具有典型的MYB保守氨基酸,并与其他物种中正向调控花色苷积累的MYB转录因子同源性较近。Real-time PCR方法分析发现FhPAP1L1和FhPAP1L2在香雪兰Red River~?不同开花时期、不同组织中具有不同的表达模式,但是在盛开时期和花器官中都有较高的表达,暗示其可能参与了花色苷积累调控。构建真核表达载体转染拟南芥和烟草,转基因植株不同组织和器官中的着色加深,其花色苷含量明显增加,通过进一步的原生质体瞬时转染实验发现FhPAP1L1和FhPAP1L2可以通过与转基因植株中内源bHLH转录因子相互作用,形成复合物参与花色苷合成基因的表达调控。通过进一步原生质体瞬时转染实验发现,香雪兰FhPAP1L1或FhPAP1L2与拟南芥AtPAP1的作用机制存在差异。拟南芥AtPAP1单独不能够激活花色苷合成相关结构基因的表达,也不能单独激活内源bHLH转录因子AtTT8,其必须以MBW复合物的形式发挥作用;而香雪兰FhPAP1L1或FhPAP1L2既可以单独激活花色苷前期合成基因的表达,又可以单独激活AtTT8,并进一步与其形成复合物调控花色苷后期合成基因的表达。2.负向调控香雪兰花色苷合成的MYB转录因子基因的克隆和鉴定利用香雪兰Red River~?盛开时期花朵转录组数据进行本地和NCBI在线BLAST,结果筛选并克隆得到香雪兰Red River?花朵中两条可能负向调控其花色苷合成的R2R3-MYB转录因子FhMYB4L和R3-MYB转录因子FhCPCL。生物信息学分析发现FhMYB4L具有典型的抑制结构域,而FhCPCL不包含任何抑制结构域。进化树分析发现它们分别与其他物种中负向调控花色苷合成的R2R3-MYB转录因子和R3-MYB转录因子同源性较近。Real-time PCR方法分析发现FhMYB4L和FhCPCL在香雪兰Red River~?不同开花时期、不同组织中具有不同的表达模式,但是在盛开时期和花器官中都有较高的表达,暗示其可能参与了花色苷积累调控,并具有调控其他生物途径的功能。构建了真核表达载体并成功转染拟南芥和烟草,发现FhMYB4L不仅能够抑制拟南芥类黄酮的积累,也能抑制烟草花朵类黄酮的合成;而FhCPCL只能抑制拟南芥类黄酮的合成。此外,FhMYB4L和FhCPCL都参与了拟南芥细胞命运决定过程,它们在拟南芥中的过量表达能够成功抑制拟南芥表皮毛的发生。同时,通过拟南芥原生质体瞬时转染实验发现,FhMYB4L和FhCPCL虽然都是通过与植株内源的bHLH转录因子相互作用进而参与调控靶基因的表达,但是,它们具体的调控机制存在明显的差异。FhMYB4L通过与MBW复合物成员bHLH转录因子相互作用,进而以辅助因子的形式结合到MBW复合物上,利用其本身具有的强转录抑制活性,将原本起正向调控作用的MBW复合物转变为具有抑制活性的MBW复合物,进而抑制下游基因的表达。FhCPCL通过与MBW复合物成员bHLH转录因子相互作用,进而阻碍了起正向调控作用的MBW复合物的形成,以达到抑制下游相关基因表达的效果。3.调控香雪兰花色苷合成的WD40蛋白基因的克隆和鉴定利用香雪兰Red River~?盛开时期花朵转录组数据进行本地和NCBI在线BLAST,结果筛选并克隆得到香雪兰Red River~?花朵中可能调控其花色苷合成的WD40转录因子FhTTG1L。生物信息学分析发现其具有典型的WD重复结构域,并与单子叶物种中调控花色苷积累的WD40转录因子同源性较近。Real-time PCR方法分析发现FhTTG1L在香雪兰Red River~?不同开花时期的表达模式与花朵中花色苷的积累模式高度相似;其在不同组织中的表达模式,暗示了FhTTG1L不仅仅参与了花朵花色苷合成的转录调控,而且也参与了其他生物过程的转录调控。构建了真核表达载体并转染拟南芥ttg1突变体发现,FhTTG1L可以恢复突变体植株中花色苷和原花青素的积累以及表皮毛发生等。通过进一步的原生质体瞬时转染实验发现FhTTG1L通过与转基因植株中内源bHLH转录因子相互作用,以稳定MYB-bHLH复合物的形式,增强对花色苷合成基因的表达调控。通过进一步原生质体瞬时转染实验发现,香雪兰FhTTG1L需要FhGL3L的协助才能进入细胞核中发挥转录调控作用,而FhTT8L和FhTTG1L只有相互协助才能进入细胞核。4.调控香雪兰花色苷合成的MBW复合物调控机制通过以上研究发现,香雪兰中存在参与调控花色苷合成的MYB转录激活子FhPAP1L1和FhPAP1L2,MYB转录抑制子FhMYB4L和FhCPCL,bHLH转录因子FhTT8L和FhGL3L,以及WD40转录因子FhTTG1L。这些转录因子在拟南芥或烟草中都可以与植株内源的转录因子相互作用,形成新的MBW复合物以调控靶基因的表达。为了进一步验证这些转录因子在香雪兰体内的作用机制,我们采用原生质体瞬时转染技术证明了它们之间也存在着相互作用网络,并可以形成多种MBW复合物参与花色苷合成相关基因的转录调控。香雪兰花色苷合成过程中存在着复杂而精细的分级调控机制和反馈调控机制。在香雪兰花朵着色过程中,花色苷早期合成基因受单独的FhPAP1L1或FhPAP1L2,以及包含有FhGL3L的MBW复合物调控,而后期合成基因受FhPAP1L1或FhPAP1L2,FhTT8L或FhGL3L,以及FhTTG1L等转录因子形成的多种复合物的调控,其中FhPAP1L1-FhTT8L-FhTTG1L复合物可能发挥主要作用。FhPAP1L1-FhTT8L-FhTTG1L复合物成员与FhPAP1L2-FhGL3L-FhTTG1L复合物之间可能存在分级调控关系,而且这两个复合物可能在花朵发育不同时期发挥作用,复合物FhPAP1L2-FhGL3L-FhTTG1L可能起始了花色苷的合成,而复合物FhPAP1L1-FhTT8L-FhTTG1L可能在花朵着色过程中发挥重要作用。其他MBW复合物可能以冗余的形式参与调控作用。复合物之间也存在反馈调控机制。起正向调控作用的MBW复合物可以激活两种MYB抑制子FhMYB4L和FhCPCL的表达,FhMYB4L通过与MBW复合物成员bHLH转录因子相互作用,进而以辅助因子的形式结合到MBW复合物上,利用其本身具有的强转录抑制活性,将原本起正向调控作用的MBW复合物转变为具有抑制活性的MBW复合物,进而抑制下游基因的表达;FhCPCL通过与MBW复合物成员bHLH转录因子相互作用,进而阻碍了起正向调控作用的MBW复合物的形成,以达到抑制下游相关基因表达的效果。