研究背景脑卒中是以脑部缺血及出血性损伤症状为主要临床表现的疾病,俗称脑中风,具有极高的病死率和致残率,其中缺血性脑梗塞约占中风发病率的85%。全球每年约有600万人死于脑卒中,是全世界导致死亡的第二病因。近几十年来,研究人员在脑卒中的防治方面做了大量工作,如积极抗凝、溶栓、急诊介入以及微创手术等方法,极大的改善了脑卒中患者的预后。尽管如此,幸存者中约3/4的人因病情严重或复杂、就诊不及时等原因留下偏瘫等后遗症状,部分病人丧失劳动能力和生活能力,给家庭带来沉重的经济负担和精神压力,给社会带来的经济损失[1]。因此,脑卒中的预防和治疗己成为现代医学科学研究的重大课题之一。钙/钙调素依赖蛋白激酶Ⅱ(CaMKII)是大脑中表达丰富的蛋白激酶之一,在神经的传导,突触的可塑性和脑突触的连接上发挥重要的生物学功能。CaMKII包括四种亚型分别为CaMKIIα,β,γ,δ,他们由不同的基因编码并显示不同的重叠和表达,CaMKⅡδ作为CaMKII的一个亚型在缺血过程中功能比较复杂,与缺血模型以及缺血时间相关[2,3]。脑卒中会导致神经元的损伤,但CaMKII的活化程度与神经元损伤的程度在不同的时间点和不同的损伤位置会有所不同,短期抑制CaMKII能够保护神经元免受兴奋毒性导致的神经元死亡[4,5]。延长对CaMKII的抑制时间,使谷氨酸含量增加,促进神经元死亡。其他体外缺血缺氧模型(OGD/R)的研究也表明,强烈抑制CaMKII能够加重谷氨酸导致的兴奋毒性损伤[4,6]。已有研究主要致力于CaMKII α或CaMKII的全酶的研究上。作为CaMKII的一个亚型,CaMKⅡδ是一种多功能的信号蛋白,有多个转录本,可以调节多种生理过程,包括细胞分化,离子通道功能,调节炎症和增殖反应,及血管平滑肌的增生。参与多种病理过程,如缺血/再灌注损伤过程中诱导心肌细胞凋亡,但CaMKII δ参与中枢神经系统的细胞凋亡的研究还很有限。文献报道,在大鼠急性脑损伤(traumatic brain injury(TBI)模型中,CaMKⅡδ表达增高,这可能与神经细胞的凋亡和恢复有关,但具体机制还不清楚[3,7]。因此通过lncRNA这个切入点,或许能从另一个层面解释CaMKII在调节疾病生理过程中,功能复杂多样的现象。现阶段,基因组学研究表明,大约只有1%的基因可转录成有蛋白编码功能的RNA,而大部分转录成无蛋白编码功能的RNA,即非编码RNA。其中,长链非编码RNA(lncRNA)是真核细胞中一类转录本长度大于200个核苷酸,但无或很少具有蛋白编码功能的RNA,曾被认为是基因转录的副产物或“暗物质”,不具有生物学功能。随着lncRNA功能学的进展,越来越多的研究表明lncRNA在人类疾病中发挥重要作用[8,9]。本课题前期采用美国Arraystar公司大鼠lncRNA芯片研究了局部脑缺血回流再灌注24小时后大鼠大脑皮层缺血半影区脑组织lncRNA的表达情况,通过生物信息学技术分析,筛选得到了差异表达的lncRNA谱。基于前期的研究基础,本课题在差异表达lncRNAs谱的中,进一步筛选出一条能够稳定表达的lncRNA并命名为C2dat1。研究了调控靶基因CaMKⅡδ的表达,以及如何发挥功能,并探讨其可能的作用机制及信号通路,可在lncRNA水平上进一步了解脑缺血后神经元死亡的原因,为治疗脑卒中提供新的靶点,期望为日后有效预防或控制脑卒中提供新的思路。目的1.研究脑缺血后差异表达的lncRNA 调控靶基因CaMKII δ的表达和功能的机制。2.丰富lncRNAs的生物学功能。3.在lncRNAs水平了解脑缺血后神经元死亡机制。4.为治疗缺血性脑卒中提供新的靶点和新思路。方法1.局灶性脑缺血再灌注模型采用线栓法建立大脑中动脉闭塞(MCAO)动物模型[1]。再灌注后处死小鼠,取脑并进行分析。连续冠状切片(1毫米)TTC染色评估梗死面积。从缺血核心区和周围缺血半暗带分离脑组织快速冷冻在液氮中用于RT-qPCR,Western blot实验。2.细胞培养与OGD/R模型N2a细胞从美国ATCC购买用基本培养基(MEM)加10%FBS在5%CO2,37℃细胞培养箱培养[10]。小鼠大脑皮层神经元原代培养;从14-16日龄C57BL/6小鼠胚胎提取皮层组织原代神经元培养[1]。OGD/R模型;模拟缺血条件下体外培养,用无糖的培养基取代完全培养基。细胞被放置在(37±1℃)厌氧室(Forma Scientific),含5%的C02和95%N2混合气体中培养3 h(N2a)或1H(原代神经元细胞)[1]。OGD后,用含10%胎牛血清的高糖培养基在常氧条件5%CO2 37℃继续培养不同时间点,收集细胞。3.核质分离用150mm的培养皿培养N2a细胞,分别收集未处理组细胞和OGD/R24h组的细胞,PBS重悬洗涤一次,1OOOr/min离心5min,收集沉淀。加入冰低渗裂解缓冲液,冰上孵育15min,溶解物转移并在4℃ 500xg离心5分钟。上层清液包含细胞质,加入乙酸钠,pH 5.5,加100%乙醇至调整至70%乙醇,-20℃沉淀过夜。沉淀物为细胞核用冰HLB清洗三次,移液涡旋并悬浮于冰的Wuarin-Schibler缓冲液。样品涡旋10min后,在冰上孵育30min,接着在4℃ 500xg离心5min。上层清液包含核质片段,乙酸钠,pH 5.5,加100%乙醇至70%,-20℃过夜。收集沉淀为核质,余下为染色质。染色质用冰的MWS清洗三次后加入Trizol,进行RNA提取[9]。4.荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)针对NCBI公布的小鼠AK153573序列且避开与CAMK2D mRNA重叠的序列,通过 Stellaris Probe Designer(http://www.biosearchtech.com/stellarisdesigner/)软件用dye Quasar(?)570标记得探针48条并由Biosearch Technologies公司合成。根据 www.biosearchtech.com/stellarisprotocols 提供的 RNA 原位杂交说明书,完成杂交后,N2a细胞核复染DAPI,固定,共聚焦显微镜下观察[11]。5.siRNA 转染N2a细胞接种于六孔板中,接种密度为3× 104细胞/孔。根据转染试剂GE dharmacon使用说明处理细胞用50-75 nm的终浓度的siRNA转染细胞。C2dat1 siRNA,CAMK2D siRNA 和 siRNA,以及 Non-target siRNA(NTsiRNA)(阴性对照)转染后的第二天,N2a细胞或OGD处理,后再分别复氧复糖培养不同时间(0,12,24 h)进行后续处理。6.免疫荧光染色对小鼠脑组织切片进行免疫荧光染色,用抗体CaMKⅡδ或小鼠抗微管相关蛋白-2(MAP2)孵育切片后用TBS洗3次,用羊抗兔IgG的Alexa Fluor 488 CaMKII δ孵育和一抗兔抗鼠MAP2孵育。入FITC标记羊抗兔Ig G二抗,37℃,20 min,PBS液洗涤3次,5 min/次.核染色topro-3封闭液封闭,防淬灭封片剂封片。阴性对照用PBS液代替一抗,只用二抗对脑切片染色在激光共聚焦显微镜下观察。7.RT-qPCR法各个样品分别取总RNAlug,用cDNA合成试剂盒反转录生成cDNA,反转录生成的 cDNA 用 ssofast EvaGreen supermix 在 CFX96 real timePCR 检测系统实行荧光定量PCR进行扩增表达,用GAPDH作为内参。8.免疫印迹分析法细胞处理后加裂解缓冲液裂解细胞,收集各组样品蛋白,BCA法测定蛋白浓度后按公式定量蛋白,按15ug上样量每孔蛋白质进行上样跑胶后湿法转膜。在4℃,加入一抗孵育过夜,冲洗后,在室温下二抗孵育1小时。用增强化学发光法检测蛋白(ECL)试剂盒显影[12]。图像通过Image J软件分析。9.细胞增殖率实验(cck-8法)采用细胞计数法检测细胞存活率。根据说明书,细胞接种在96孔板中,分别根据不同的实验目的和实验处理方法处理细胞后,每孔细胞加cck-8溶液,孵育1-4小时后在450 nm处测量细胞增殖/存活率。与未处理组相比计算细胞存活率。结果1.局灶性脑缺血诱导小鼠C2dat1和CAMK2D表达上调。在小鼠I/R模型中检测C2dat1以和CAMK2D表达量。在缺血核心区,C2dat1和CAMK2D在6小时突然上调,24h时逐渐下降至基础水平,存在大量的神经元死亡。而在半影区C2dat1和CAMK2D呈时间依赖性上调,24 h后缺血半影区CAMK2D表达增加了近4倍。总之,局灶性脑缺血诱导C2dat1和CAMK2D mRNA的表达在在缺血中心区和半暗带区不同。2.局灶性脑缺血后缺血半暗带及原代培养神经元体外OGD/R模型中CaMKⅡδ表达上调。通过免疫荧光染色,我们发现CaMKⅡδ在病灶半暗带表达增加,在缺血中心区表达降低小。Western印迹分析组织缺血中心区CaMKⅡδ的表达下调,在缺血半暗带表达上调,而对侧的表达水平在所有时间点保持不变。在原代皮层神经元OGD/R24h处理后,CaMKⅡδ表达上调。说明小鼠CaMKⅡδ与缺血相关的生物过程有潜在的相关性。3.C2dat1对 CAMK2D/CaMKⅡδ 调控作用采用小鼠N2a模拟体外缺血模型(OGD/R),进一步评价C2dat1对CAMK2D/CaMKII δ的调节作用。OGD/R诱导的时间依赖性细胞死亡在24h后趋于稳定。在复氧不同时间点收集细胞,实时荧光定量PCR法检测C2dat1和CAMK2D转录水平后。我们得到OGD/R引起C2dat1在48 h内上调,其中约12h达到高峰,然后下降。同时,CAMK2D也响应OGD/R上调,12和24小时达到最高值,36 h和48 h回到基线。因此,在N2a细胞中,OGD/R诱导C2dat1和CAMK2D/CaMKⅡδ表达。4.C2dat1的定位。生物信息学分析发现C2dat1与CAMK2D内含子13-15和外显子14有序列重叠。我们采用核质分离技术分离出细胞核,核质和细胞质。采用实时定量RT-qPCR检测细胞核,核质和细胞质中C2dat1的表达量。数据表明,C2dat1主要表达在N2a细胞的细胞核内。同时用RNA荧光原位杂交分析也证实,C2dat1主要位于细胞核。5.C2dat1可调节 CAMK2D/CaMKⅡδ 的表达,沉默 阻断 CaMKⅡδ 蛋白表达,加速神经元的死亡。用si-C2dat1转染N2a细胞48h后,能够明显抑制C2dat1 mRNA的转录水平。沉默C2dat1显著阻断OGD/R诱导的CAMK2D表达。此外,CaMKII基因产生多个亚型的选择性剪接体,用siRNA沉默C2dat1,发现沉默C2dat1,能阻断转录本CAMK2D1/4的上调,部分抑制转录本CAMK2D 5/9,但对转录本CAMK2D 2/3没有影响,这意味C2dat1可以选择性调节转录本CAMK2D1/4,CAMK2D 5/9表达。CCK-8分析,沉默C2而t1加速神经元的死亡。6.C2ddat1通过激活NF-κ B信号通路促进神经元存活。通过利用RNAi技术确定了 OGD/R诱导的C2dat1对神经细胞的保护功能。OGD/R诱导C2dat1表达上调,进而调节相应的mRNACaMKⅡδ蛋白表达,激活NF-kB信号通路提高神经元的存活率。表明缺血诱导的C2dat1/CaMAKIIδ/NF-κB通路在N2a细胞中起神经保护作用。结论:1.C2dat1是一条新的由缺血再灌注诱导的与CAMK2D相关lncRNA。2.I/R模型,半暗带C2dat1及CAMK2D表达上调。N2a细胞在OGD/R后C2dat1和CAMK2D/CaMKⅡδ表达上调,原代皮层神经元(OGD/R)中,CaMKⅡδ表达上调。说明C2dat1,CAMK2D/CaMKⅡδ与缺血相关的生物过程的潜在相关性。3.沉默C2dat1阻断CaMKⅡδ蛋白表达,促进神经元的凋亡。说明C2dat1可能通过调节CaMKⅡδ的表达发挥生物学功能。4.C2dat1可能是通过激活NF-κB信号通路促进神经元存活。