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从牙周膜组织分离得到的牙周膜干细胞(Periodontal ligament stem cells,PDLSCs)是一种重要的间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)。PDLSCs在维持牙周微环境稳态、平衡牙周支持组织生理性改建、调控乳恒牙替换期间牙根吸收的起到重要作用。和大多数MSCs一样,体外分离培养的PDLSCs具有良好的增殖、分化、免疫调控潜能,在牙周再生医学方面引起越来越多的关注。动物实验表明,PDLSCs在一定条件下,可以体内再生出复杂的牙周支持结构(牙槽骨-牙周韧带-牙骨质)。种种实验结果都提示我们,PDLSCs有望成为未来临床医生手中功能性牙周支持再生的重要工具。随着再生医学的发展,年龄因素对PDLSCs细胞性能的影响越发受到学者们的关注。老年个体来源PDLSCs在体内外培养过程中,细胞增殖潜能、克隆形成能力、迁移和骨向分化潜能都显著低于年轻个体来源PDLSCs。而临床牙周炎患者,多集中在中老年人,如果利用自体来源PDLSCs进行牙周炎的治疗,老年PDLSCs干性下降或丧失是必需解决的关键问题。干细胞体外培养过程中,通过一些有效的预处理方法,可以显著增强干细胞性能。最新研究发现,白藜芦醇(反式-3,5,4’-三羟基茋,resveratrol)除能够抑制炎症反应、抑制心血管系统疾病和肿瘤发展外,其在体内的作用还包括促进造骨细胞分化和抵抗细胞衰老等。在此过程中,白藜芦醇活化Sirtuin家族中的SIRT1因子,在NAD+的辅助作用下降低了衰老干细胞中乙酰化P53的水平,从而逆转了细胞的增龄性改变,提示白藜芦醇预处理,有望增强老年PDLSCs性能。近来也有研究表明,将干细胞置于低氧环境中进行短时间的培养能够改善细胞性能。已有研究证实,PDLSCs在经过缺氧预处理之后,增殖潜能和迁移能力得到了显著提升;缺氧条件下高表达的HIF1-α蛋白可以增强PDLSCs牙骨质形成的能力。寻求一种有效的老年PDLSCs预处理方法,有望加速干细胞治疗牙周病的临床转化进程。目的通过白藜芦醇单独或联合缺氧预处理老年PDLSCs,寻求一种简单、有效的老年PDLSCs预处理方法,逆转年龄因素对干老年PDLSCs的影响。方法1、年轻和老年PDLSCs分离、培养和鉴定:采用酶解法获取PDLSCs,有限稀释法纯化PDLSCs,流式检测鉴定PDLSCs。2、年轻和老年PDLSCs性能比较:噻唑蓝(Methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法检测细胞增殖,结晶紫染色检测细胞集落形成能力(Colony forming unit-rate,CFU-R),条件培养基诱导骨结节形成,Western Blot和RT-PCR检测细胞SIRT1及骨向分化相关因子表达情况。3、白藜芦醇预处理对老年PDLSCs性能的影响:老年PDLSCs经白藜芦醇处理3d后,Western Blot和RT-PCR检测白藜芦醇对老年PDLSCs骨向分化相关因子和SIRT1因子的表达影响,MTT检测接受不同处理后PDLSCs增殖曲线的改变,结晶紫染色检测CFU-R。4、白藜芦醇联合缺氧预处理老年PDLSCs的影响:老年PDLSCs经白藜芦醇处理3 d后,给予1%O2缺氧处理24 h,随后检测细胞增殖、克隆形成和骨向分化潜能。5、统计学分析:实验最终得到的数据使用统计学软件SPSS 19.0进行统计分析,两样本间比较采用独立样本t检验,采用One-Way ANOVA进行多样本间的分析比较,结果以均数±标准差表示,当p<0.05认为存在统计学差异,使用GraphPad Prism 5生成统计图表。结果1、采取酶解法,成功获取年轻PDLSCs和老年PDLSCs,倒置显微镜下细胞形态大多数呈长梭形,流式检测两组细胞均能够阳性表达和MSC相关的表面标记物(CD44、CD90和CD105),而阴性表达和造血干细胞相关的表面标记分子(CD31和CD34);虽然两组干细胞均具备增殖和克隆形成潜能,但老年PDLSCs增殖和克隆形成能力要显著弱于年轻PDLSCs(p<0.001或p<0.01);骨向分化诱导结果显示,老年PDLSCs成骨结节能力弱于年轻PDLSCs,相关成骨相关因子的表达均低于年轻PDLSCs(p<0.05或p<0.01或p<0.001);Western Blot和RT-PCR结果显示SIRT1因子的表达在老年个体来源PDLSCs中出现减弱。2、白藜芦醇预处理老年PDLSCs,细胞增殖、克隆形成和骨向分化潜能具有明显提高,RT-PCR结果表明,白藜芦醇提高了成骨相关基因在老年个体PDLSCs中的表达(p<0.05),Western Blot检测,也证实了蛋白水平具有显著提升。3、在白藜芦醇处理的基础上,给予细胞24 h缺氧预处理,提高了老年PDLSCs增殖潜能(p<0.05),但联合处理后的老年PDLSCs,骨向分化潜能反而受到了抑制(p<0.001)。结论1、和年轻PDLSCs相比,老年PDLSCs增殖、克隆形成和骨向分化潜能减弱,SIRT1活性下降。白藜芦醇预处理可以增强老年PDLSCs中SIRT1的活性,提高了细胞增殖能力、克隆形成能力以及骨向分化能力。白藜芦醇联合缺氧预处理,促进HIF1-α表达,提高细胞增殖能力,但降低SIRT1的表达,细胞骨向分化潜能受到抑制。2、白藜芦醇预处理是提高老年PDLSCs细胞性能的有效方式,然而,其所使用的的药物浓度,处理时间仍然需要我们进一步深入研究。虽然白藜芦醇联合缺氧预处理并没有取得我们理想中的实验结果,但是缺氧条件下,细胞内SIRT1和HIF1-α因子之间的相互作用机制以及产生的结果,仍然值得科研工作者采取更进一步的研究。