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目的人巨细胞病毒(HCMV)在人群中普遍感染,尽管HCMV在健康个体中的感染通常是无症状性感染,但对于存在免疫缺陷的个体,HCMV是导致其患病和死亡的主要原因。HCMV也是目前公认的引起先天性感染最常见病原体,常导致新生儿畸形的发生。细胞自噬(autophagy)是一种主要由溶酶体介导的降解通路,作为细胞维持内环境稳态的一种保护性机制,不仅可以通过将长寿命蛋白和衰老细胞器降解为小肽或氨基酸为细胞提供再生资源,而且也可作为宿主防御机制抵抗病原微生物的感染和寄生。近年对HCMV与自噬关系的研究也取得重要进展,但现有关于HCMV和自噬之间关系的研究都是在HCMV增殖感染的细胞上进行的,对于HCMV潜伏感染这种人群中更为普遍的感染模式,目前国内外尚无文献报道其对自噬的影响。明确HCMV潜伏感染时对细胞自噬的影响,这将有助于阐明HCMV潜伏感染的发病机制,同时为HCMV防治药物和疫苗的研发提供新靶标。方法本研究主要包括两部分：1)人巨细胞病毒潜伏感染模型的建立：以HCMV感染人胚肺成纤维细胞(Human Embryo Lung Fibroblast,HEF)作为HCMV增殖感染对照组,以未感染的人急性单核白血病细胞(human acute monocytic leukaemia cellline,THP-1)作为空白对照组,用HCMV Towne株分别感染THP-1细胞和HEF细胞,倒置显微镜下观察细胞形态；在感染后6h、5d、7d时去培养上清,收集细胞,用DNA抽提试剂盒提取细胞内总DNA,荧光定量PCR检测THP-1细胞内HCMV的DNA拷贝数；Trizol法提取细胞总RNA, RT-PCR检测HCMVIE1、IE2和UL81-82ast基因的表达水平；用RIPA强裂解液裂解细胞,提取细胞总蛋白,western-blot检测HCMVIE蛋白水平。构建稳定的HCMV潜伏感染模型。2)人巨细胞病毒潜伏感染下细胞的自噬现象：透射电镜下观察HCMV Towne株感染THP-1细胞后能否在超微结构水平诱导自噬体的出现,并与空白组进行对比；RT-PCR法定量分析HCMV Towne株感染THP-1细胞内自噬相关基因LC3、Beclin-1和Atg5的转录水平；western-blot法检测自噬相关蛋白LC3、Beclin-1和Atg5的表达水平,并和未感染HCMV Towne株的空白组进行对比分析。结果成功构建HCMV潜伏感染模型。荧光定量PCR结果显示：每个THP-1细胞内HCMV DNA拷贝数大约在1.5个,在感染后1-5d逐渐增加,5d后逐渐减少；RT-PCR结果显示:HEF细胞和THP-1细胞感染HCMV Towne株后均有HCMV即刻早期基因IE和潜伏相关基因UL81-82astmRNA的表达。HCMV Towne株感染的THP-1细胞,IE2基因mRNA在感染后6h、5d均有表达,7d后基本不表达；IE1基因mRNA表达一直不明显；UL81-82ast基因1nRNA在感染后6h即有表达,并且一直持续到感染后7d。Western-blot结果显示：在HCMV感染的HEF细胞,HCMV IE蛋白在感染后6h即有表达,感染后5d、7d表达增加。在THP-1细胞,IE蛋白在感染后6h、5d有表达,感染后7d时IE不表达。HCMV Towne株感染THP-1细胞能够促进细胞的自噬,和空白组THP-1细胞相比,电镜结果显示：Towne株感染THP-1细胞后,与空白组相比,病毒感染后1d就能诱导细胞内出现双成膜结构的自噬体。在感染后5d,细胞浆内出现大量自噬体和自噬溶酶体,局部也能见到池状弯曲的双成膜结构的自噬前体,以自噬溶酶体居多。感染后9d,细胞内仍可见自噬体和自噬溶酶体的存在,但仍以自噬溶酶体为主。相比较之下,空白组细胞浆内几乎没有自噬相关囊泡的出现。电子显微镜下,随机选取10个空白组细胞和感染后1d、5d、9d的感染组细胞各10个,在不同的非连续性区域计数细胞内自噬相关囊泡的数量：空白组细胞约2-3个自噬体或自噬溶酶体；感染后1d的细胞约10-13个；感染后5d的细胞约80个；感染后9d的细胞约30个。与空白组相比,自噬相关基因LC3、Beclin-1和Atg5的转录和表达在HCMV感染后明显增加。促进自噬的强度也存在变化：HCMV感染THP-1细胞5天后,在THP-1细胞上能建立稳定的潜伏感染,在潜伏感染期间,HCMV促进细胞自噬的强度较未建立潜伏感染之前减弱,表现为自噬相关基因LC3、Beclin-1和Atg5的转录和表达在潜伏期间逐渐减少,但和空白组细胞相比转录和表达水平仍高。结论1、成功构建了HCMV Towne株在THP-1细胞上稳定的潜伏感染模型；2、HCMV感染促进THP-1细胞的自噬,但是在建立潜伏感染后,促进细胞自噬强度较未建立潜伏感染时减弱。