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禽流感（avian influenza,AI）由正粘病毒科A型流感病毒引起的全身性传染病,国际兽疫局（OIE）将其定为A类传染病,不仅严重危害养禽业,而且给公共卫生造成巨大威胁,因此国家将防治禽流感作为重要任务。目前,对禽流感的主要检测技术有血凝-血凝抑制（HA-HI）试验、酶联免疫吸附试验（ELISA）、聚合酶链式反应（PCR）和胶体金等方法。前者比较敏感,但受外界因素影响较大而削弱了其实用价值;ELISA适合于大批量血清学调查,但因其条件要求高,现场操作不便;PCR虽然可直接检出病毒的基因,但所需的设备昂贵,在临床检测方面受到了很大的限制;胶体金方法目前国内、外均有相关的产品问世,但其检测灵敏度不高,只能定性,不能定量,该方法只能用于疫病诊断的辅助检测。因此探索高效、特异、准确的检测手段对于禽流感的防控具有十分重要的意义。现有的禽流感血清学检测技术主要利用抗原抗体的反应,而目前国内禽流感病毒抗体产品质量参差不齐,国外已有比较成熟的商品化抗体,抗体试剂主要依赖于进口,但价格较昂贵。制备高效价、低成本、特异性强的单克隆抗体可为禽流感的防控提供必备的试剂原料。极大角度光纤光栅（excessively tilted fiber grating,Ex-TFG）免疫传感器具有检测灵敏度高、特异性好、免标记、设备便携、成本低的优点,具备临床检测潜力。前期本实验室已成功将Ex-TFG免疫传感器应用于猪圆环病毒2型（PCV2）、新城疫病毒（NDV）、心力衰竭生物标记物N末端前钠尿肽（NT-proBNP）、降钙素原（PCT）以及程序性死亡配体-1（PD-L1）的检测,将抗原抗体反应的特异性与光纤光栅传感器检测的敏感性结合,在检测的灵敏度上取得了突破,并发表了高水平研究论文。本文采用原核表达系统制备禽流感病毒HA抗原,利用聚乙二醇（PEG）细胞融合技术制备单克隆抗体,为禽流感的防控提供有效试剂;此外通过对极大角度光纤羟基化修饰后,涂覆氧化石墨烯（GO）分散液,使GO均匀固定在光纤表面形成涂覆层,利用1-（3-二甲基氨丙基）-3-乙基碳酰亚胺（EDC）和N-羟基硫代琥珀酰亚胺（NHS）使涂层羧基（-COOH）活化,结合单克隆抗体后将配制好的封闭液封闭未被结合的位点,检测不同滴度禽流感病毒标准液等实验样本,对传感器的重复性,特异性,临床样本检测等进行验证,初步建立一种基于Ex-TFG的禽流感病毒免疫传感器。该传感器具有特异性强,检测成本低,时间短等优点,为禽流感病毒的临床检测提供新的检测方法。本文的研究内容如下:1、为了实现禽流感病毒H5N1血凝素（HA）蛋白在原核表达系统中高效表达,根据GenBank公布的H5N1-HA（ID=DQ023145.1）基因序列,在不改变HA蛋白氨基酸序列的情况下,根据大肠杆菌密码子偏好性利用DNAWorks2.4软件进行密码子优化,化学方法合成HA全基因,在HA基因的5’段和3’段分别设计酶切位点BamHI和EcoRI。将合成的HA基因进行BamHI和EcoRI双酶切,酶切产物回收后,插入到同样经过BamHI和EcoRI双酶切回收的pET28a（+）载体中,使用DNA Ligation Kit将HA基因克隆于pET28a（+）载体中,构建重组质粒pET28a（+）/HA。将重组质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）感受细胞中,优化各项因素（温度、诱导剂浓度、时间）,并筛选出最佳诱导条件,进行大量表达。利用His-tag镍柱纯化HA重组蛋白,并对纯化后的重组蛋白进行SDS-PAGE纯度分析、二喹啉甲酸（BCA）法浓度测定及Western-blot特异性鉴定。2.将上述制备的H5N1-HA蛋白作为免疫原,采用长程免疫法免疫BALB/c小鼠,取4次免疫后的小鼠脾脏制成脾细胞悬液,然后与骨髓瘤细胞混合,以PEG1500作为融合剂进行细胞融合;对融合细胞以及多次亚克隆后细胞上清中的抗体采用间接ELISA法进行筛选,将筛选到的阳性孔进行至少2次以上的亚克隆,最终获得可稳定分泌抗体的单克隆阳性杂交瘤细胞,扩大培养细胞并制备单抗腹水,对抗体进行亚型鉴定,并根据抗体亚型,选择相应的纯化方法进行纯化,对纯化后的抗体进行生物特性鉴定。3.对极大角度光纤光栅（Ex-TFG）表面进行外膜保护层刮出后,用5%的稀HNO3进行光纤洁净化处理;利用8mg/mL的NaOH溶液进行表面羟基化修饰后,使光纤表面带有羟基（-OH）,均匀涂覆GO分散液,做干燥固定处理后电子显微镜观察涂敷情况,石墨烯良好的水溶性极有利于包裹在光纤周围,形成致密膜层。涂敷良好后固定禽流感单克隆抗体并封闭表面多余位点处理,再进行禽流感病毒的检测,并对此生物免疫传感器的重复性、特异性以及临床应用进行评定。结果:1.重组菌株pET28a（+）-HA/BL21（DE3）在诱导条件为30℃、IPTG浓度为1mmol/L诱导10h时,HA蛋白表达量最高;SDS-PAGE电泳显示菌体裂解之后上清表达量明显高于沉淀,表明为可溶性表达,经镍柱亲和层析纯化所得HA蛋白纯度较高,达到了90%以上,Western blot显示在70KD处有明显的蛋白印迹条带,与预期相符,表明成功实现了HA蛋白在大肠杆菌高效表达。2.制备HA单克隆抗体,进行了一次细胞融合,铺96孔板共4块板,其中克隆生长数为380孔,融合率为98.95%。阳性孔数为323孔,阳性率分别为84.1%;经过3次亚克隆并筛选,获得了4株具有抗禽流感HA的单克隆抗体细胞株,命名为1H8-F12,4G1-G11,4G1-E12,4G1-B11;经过亚型鉴定后1H8-F12,4G1-G11为IgG2b型抗体,4G1-E12为IgG2a型抗体,4G1-B11为IgG1型抗体;4株杂交瘤细胞株经反复冻存、复苏及多次传代,均能分泌高效价抗体;经Western-blot鉴定后证实所获得单抗是特异性针对禽流感病毒HA抗原;将1H8-F12,4G1-G11细胞腹腔注射BALB/c小鼠,并收集了腹水,利用ProteinA柱进行纯化,SDS-PAGE电泳显示纯化后抗体纯度达到了90%以上,选取同一批次纯化所得峰值最高的收集液,使用BCA法测得其浓度最高值可达到2.6637 mg/mL。3.开展了对极大角度光纤羟基化修饰,GO涂覆,涂层活化,抗体固定,封闭,病毒检测,重复性,特异性,临床样本检测等各项实验研究,并进行了测试分析,结果显示:进过表面羟基化修饰后、涂敷氧化石墨烯、涂层活化、结合禽流感抗体的谐振波长偏移量分别为:0.027nm、0.065nm、0.022nm以及0.096nm,表明各步修饰成功进行。该免疫传感器对AIV的最低检测极限值（LOD）为0.1ng/mL（1.43pM）,检测的线性范围为0.1-5000ng/mL,达到了临床检测水平;重复性实验结果基本一致,表明传感器的重复性良好;对NDV尿囊液、AIV尿囊液两种不同的禽类病毒原液和AIV空白尿囊液进行了测试分析,结果表明该传感器对AIV具有高度的特异性,可满足临床检测要求。结论:本研究构建了禽流感病毒HA基因工程菌pET28a（+）-HA/BL21（DE3）,并筛选了最佳表达条件,成功实现了H5N1-HA蛋白在大肠杆菌中高效表达,制备并纯化了重组H5N1-HA蛋白;经过抗原免疫、细胞融合及克隆化筛选后得到4株能够稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株;利用制备的抗原、抗体,初步建立了基于GO涂敷的Ex-TFG的生物免疫传感器,并用于检测禽流感病毒。本研究制备的禽流感病毒重组HA抗原及单抗将为禽流感的防控提供有效试剂,研制的传感器具有检测灵敏度高,可重复性好、特异性强、可用于临床样品实时定量检测,为禽流感的防控提供了新的检测技术和方法。