右美托咪定对脓毒症导致的小鼠脑损伤的保护作用及其机制的研究

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[研究背景及目的]脓毒症实际上是一种炎症反应综合征(SIRS),患者通常有已经明确的或高度可疑的感染。脓毒症会导致多器官功能障碍、脓毒症性休克等多种并发症。脓毒症以及其相关并发症,是临床上危重症患者最常见的死因。脓毒症相关性脑病(Sepsis-associatedencephalopathy,SAE)是脓毒症的常见并发症,是指经过临床以及实验室检查后,缺乏中枢神经系统感染的直接证据,无脑部结构的异常,以及排除其他类型脑病(如肝性或肾性脑病),伴随脓毒症而产生的弥漫性的脑功能障碍。在临床上SAE的诊断主要是排除性诊断。其急性期主要表现为不同程度的意识状态改变。相比于不伴发脑病的脓毒症患者,脓毒症伴SAE的患者急性期的死亡风险升高,远期还更易并发认知功能障碍。临床上对于SAE患者,推荐给予一定程度的镇静处理。右美托咪定(Dexmedetomidine,Dex ),作为临床上效果确切的麻醉辅助用药,由于其优良的功效包括镇静、抑制交感活性、镇痛、对呼吸无明显抑制等优点,已被推荐用于部分重症监护病房内患者的短时间(< 24 h)镇静。Dex的免疫调节作用以及其器官保护作用受到越来越多的关注,其神经保护作用已经在多种动物模型中证实,如脑缺血再灌注损伤模型、谷氨酸诱导的新生鼠脑损伤模型,高氧导致的新生大鼠脑损伤模型等。然而关于Dex对脓毒症导致的脑损伤的影响的研究仍少有报道,因此本研究旨在研究Dex对于SAE是否具有保护作用,并探讨其可能的机制。[方法]1.实验分组及模型制备本实验选取SPF级BALB/c小鼠(约2月龄)共81只,使用随机数表法将小鼠随机分为三个处理组:正常对照组(Control组)、模型组(LPS组)、右美托咪定处理组(LPS+Dex组)。LPS组和LPS+Dex组给予腹腔注射脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS) 10 mg/kg以诱导脓毒症模型,而Control组腹腔注射生理盐水(NS,10ml/kg)作对照;LPS+Dex组在给予LPS后的Oh、2h、4h这三个时间点,均给予D ex ( 25 μg/kg )腹腔注射,而Control组和LPS组在上述三个时间点给予(NS,10ml/kg)作对照。2.取材及各项指标的检测①在进行完上述相应药物处理后,于造模8 h时每组随机取6只小鼠通过尾静脉注射2%伊文思蓝溶液(3ml/kg)。2h后,进行脑内伊文思蓝含量的检测。②另外,于造模8 h时,随机取3只小鼠按照脑组织石蜡切片制备的要求对小鼠进行相应处理,制备石蜡切片并进行HE染色和TUNEL染色。③此外,在造模8 h时,随机取12只小鼠,麻醉后颈椎脱臼法处死小鼠,取脑组织用ELISA方法检测各组小鼠脑内肿瘤坏死因子-α ( Tumor necrosis factor-α,TNF-α )、白细胞介素-1β ( Interleukin-1β,IL-1β )、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)的水平以及按照试剂盒要求,检测各组小鼠脑组织反应性氧自由基(Reactive oxygen species,ROS )的水平。④其余小鼠于造模8 h时,麻醉后颈椎脱臼法处死,取其脑组织并进一步分离为皮层及海马,分别用Western blot方法检测Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax )、B 细胞淋巴瘤 / 白血病-2 蛋白(B-cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2 )和诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,iNOS )的表达水平以及断裂的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(Cleaved cysteinyl aspartate specific protease-3, Cleaved caspase-3 ),即活化的Caspase-3 的水平。[结果]1.各组小鼠脑内伊文思蓝的含量(ng/mg ): LPS组(1.17±0.26 )明显高于Control组(0.52±0.22),差异有统计学意义(P<0.01);LPS+Dex组(0.81±0.12)与LPS组(1.17±0.26)相比明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。2. HE染色及TUNEL染色结果①HE染色结果可见Control组小鼠皮层以及海马CA1区和CA3区细胞形态未见明显异常,细胞形态规则,无皱缩,轮廓清晰。LPS模型组可观察到皮层和海马区均可见大量的异常细胞,细胞轮廓不规则,大小不一,细胞皱缩,细胞核深染等改变。经过Dex处理后的小鼠,可见其脑组织皮层及海马区域的LPS导致的神经元结构异常改变均有不同程度的缓解。②TUNEL染色结果显示LPS组小鼠皮层及海马神经元凋亡数目与Control组相比明显升高;而LPS+Dex组小鼠皮层及海马神经元凋亡数目比LPS组明显减少。3.各组小鼠脑内TNF-α、IL-1β、ROS以及MDA的水平①TNF-α ( pg/mg ): LPS 组(847.70±120.01 )明显高于 Control 组(428.71±47.01),差异有统计学意义(P< 0.01); LPS+Dex 组(348.59±158.42)与LPS组(847.70±120.01)相比明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)。②IL-1β(pg/mg):LPS 组(224.08±61.32)较 Control组(128.56±41.52)明显升高(P < 0.05 ),差异有统计学意义;LPS+Dex组(197.06±46.13 )较LPS组(224.08±61.32)显著降低(P<0.05),差异有统计学意义。③ ROS:LPS组平均荧光强度高于Control组,差异有统计学意义(P<0.01);LPS+Dex组低于LPS组,差异有统计学意义(P < 0.05 )。④MDA ( nmol/mg ): LPS 组(11.96±1.58 )显著高于 Control 组(8.29±1.02),差异有统计学意义(P<0.01);LPS+Dex组(8.70±0.92)低于 LPS组(11.96±1.58),差异有统计学意义(P<0.01)。4. Western blot 实验结果①iNOS:皮层LPS组iNOS表达水平较Control组明显升高(P < 0.01 ),LPS+Dex组iNOS表达水平较LPS组显著降低(P < 0.01 );海马LPS组iNOS表达水平较Control组明显升高(P < 0.01 ),LPS+Dex组iNOS表达水平较LPS组显著降低(P<0.05)。②Bax/Bcl-2:皮层LPS组Bcl-2/Bax的相对表达水平较Control组降低(P <0.01 ),LPS+Dex组Bcl-2/Bax的相对表达水平较LPS组明显升高(P < 0.01);海马LPS组Bcl-2/Bax的相对表达水平较Control组降低(P < 0.01 ),LPS+Dex组Bcl-2/Bax的相对表达水平较LPS组明显升高(P < 0.05 )。③Cleaved caspase-3:皮层和海马 LPS 组 Cleaved caspase-3 水平均较 Control组升高(P < 0.01 ),LPS+Dex组Cleaved caspase-3水平均较LPS组明显降低(P<0.01 )。[结论]实验结果表明Dex可以减轻LPS导致的脑内细胞异常形态改变和细胞凋亡。其保护作用可能与其减轻血脑屏障障碍,抑制炎症反应和氧化应激水平,调控凋亡相关调节因子Bax、Bcl-2的表达水平及减少Caspase-3的活化有关。
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