葡萄在我国众多经济作物中占据至关重要的地位,其栽培面积和产量均位于世界前列,但我国部分种植地区不利的生态环境给葡萄生产带来了很多问题,其中土壤盐渍化是主要的限制因素。选育耐盐葡萄砧木进行嫁接栽培,是解决这一问题的有效途径之一。与常规育种相比,通过基因工程培育耐盐葡萄砧木具有省时、高效的特点,因此,筛选、鉴定耐盐基因并研究其功能和作用机理具有重要意义。促分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)途径在植物抵御多种不良环境过程中发挥着重要作用。我们前期研究中发现了一个高度响应盐胁迫基因VvMAPKK3,进一步研究发现VvMAPK9与其互作且受到盐胁迫诱导,但其响应盐胁迫的分子机制目前还不清楚。因此,本研究以本团队选育的耐盐性较强的葡萄砧木A35(‘左山一’×SO4)为试材,克隆得到VvMAPK9基因,并对该基因的序列特征、表达模式和抗盐功能进行了分析。主要研究结果如下:(1)VvMAPK9基因的生物信息学分析。该基因的开放阅读框全长为1128 bp,编码含有375个氨基酸残基的多肽,预测分子量为42.615 kDa,等电点为6.24。亚细胞定位分析发现VvMAPK9定位于细胞核和细胞质。系统进化分析发现VvMAPK9属于MAPK的B组,多序列比对发现其氨基酸序列中含有保守的磷酸化TEY基序和C-端的CD结构域。(2)葡萄VvMAPK9基因的表达模式分析。qRT-PCR结果表明,VvMAPK9主要在葡萄砧木的幼叶、成熟叶和根中表达,在叶柄和茎中的表达量相对较低。另外,该基因的表达还受高盐、干旱、高温、低温和ABA的诱导。(3)超表达VvMAPK9基因提高了拟南芥的耐盐性。盐胁迫条件下转基因拟南芥的种子萌发率明显高于野生型,且幼苗的根明显更长。对1周苗龄的拟南芥浇灌200 mM NaCl,14天后发现野生型拟南芥植株叶片明显变黄且部分枯萎,而转基因拟南芥植株生长良好,这说明超表达VvMAPK9提高了拟南芥抵御盐胁迫的能力。(4)超表达VvMAPK9提高了葡萄愈伤组织的耐盐性。在未受到胁迫的条件下,野生型和转基因葡萄愈伤组织生长一致,但在添加了150、200 mM NaCl的培养基上,野生型葡萄愈伤组织生长缓慢且颜色发黑,而转基因葡萄愈伤组织整体呈活性较好的淡黄色,且体积明显大于野生型。对其相对电导率进行检测,发现盐胁迫下转基因愈伤组织的细胞膜透性较小,这说明超表达VvMAPK9提高了葡萄愈伤组织的耐盐能力。(5)VvMAPK9提高葡萄愈伤组织的耐盐性可能与抗氧化酶系统的激活和离子转运基因的表达有关。在盐胁迫条件下,VvMAPK9超表达葡萄愈伤组织具有更高的抗超氧阴离子活力,且其抗氧化酶SOD、POD的活性显著高于野生型。对抗逆相关基因的转录水平变化进行检测,发现超表达VvMAPK9提高了盐胁迫下葡萄愈伤组织中清除活性氧相关基因(VvSOD、VvPOD)和离子转运蛋白基因(VvNHXP、VvHKT1、VvHKT2)的转录表达,这说明VvMAPK9可能通过激活抗氧化系统以及调控离子转运蛋白基因的表达来提高葡萄愈伤组织的耐盐性。