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口蹄疫病毒（FMDV）是严重危害猪、牛等经济动物的传染病,给畜牧业造成巨大的经济损失。预防和控制这种传染病的主要措施是对潜在易感宿主进行大范围全面地免疫接种。而目前用于预防口蹄疫的常规疫苗都存在潜在的散毒危险,因此研制新型疫苗迫在眉睫。乙型脑炎是一种由日本乙型脑炎病毒（JEV）侵犯中枢神经系统引起的潜在致命性传染病。此病可通过蚊子传染给人类,而猪是公认的主要扩增宿主和传染源。目前广泛使用的无论是人乙型脑炎鼠脑纯化灭活疫苗,还是猪乙型脑炎灭活疫苗或减毒活疫苗因为其生产费用昂贵、缺少长期免疫力,潜在的散度风险以及可能引起的过敏反应等,而限制了这些疫苗被广泛应用。植物可饲疫苗与传统疫苗相比具有无动物病原体污染、生产廉价、储存和运输热稳定等优势,近年成为研究的热点。水稻作为一种生物反应器,被广泛地用于表达人和动物病原体的抗原基因。在水稻中表达FMDV或JEV的免疫原蛋白来生产新型疫苗不失为一种经济实用的策略。针对以上两种病毒,本研究通过农杆菌侵染法获得了转口蹄疫0/ES/2001株P1基因和乙型脑炎SA14-14-2株E基因的转基因水稻,并在小鼠模型上对植物来源的P1蛋白和E蛋白的生物学特性和免疫原性经行了研究。具体研究内容包括:1.P1基因和E基因在水稻中的表达分析将本实验室保存的口蹄疫0/ES/2001株P1基因和乙型脑炎SA14-14-2株E基因首先分别克隆到真核表达载体pRTL2中,再将构建成的含有双CaMV 35S启动子和NOS终止子的表达盒克隆到载体pCAMBIA1301中,分别命名为pCAMRT-P1和pCAMRT-E。用农杆菌法分别转化水稻品种日本晴（Nipponbare）,经Southern blot,Northern blot和Western blot方法检测,P1基因和E基因均在在水稻中成功表达。经ELISA方法检测,P1蛋白表达量达到0.6至1.3μg/mg植物总可溶性蛋白,E蛋白表达量达到1.1至1.9μg/mg植物总可溶性蛋白。2.水稻来源的P1蛋白免疫原性研究将新鲜转基因水稻叶片进行研磨,取研磨液与不完全弗氏佐剂混合腹腔注射免疫小鼠。首免后第56天,植物来源P1蛋白诱导小鼠体内产生了高水平的口蹄疫病毒特异性血清IgG抗体;中和抗体水平达到1:20.27,与大肠杆菌来源的P1蛋白诱导的中和抗体相当（1:22.4）。用106TCID50口蹄疫病毒0/ES/2001株进行攻毒试验,攻毒48小时后检测小鼠血液中病毒清除情况显示,100%的小鼠血液没有引起细胞病变。用水稻研磨液口服免疫的小鼠36天后,解剖小鼠并收集近胃部小肠,清洗后进行体外培养3天。口服免疫的小鼠体内也产生了口蹄疫病毒特异性血清IgG抗体,并且水稻来源的P1蛋白诱导的抗体水平显著高于大肠杆菌来源的P1蛋白诱导的。小肠洗液和体外培养液中检测到粘膜IgA抗体,证明植物来源的P1蛋白经口服诱导了粘膜免疫。用106TCID50口蹄疫病毒0/ES/2001株进行攻毒试验,攻毒48小时后检测小鼠血液中病毒清除情况显示,只有20%-40%的小鼠血液没有引起细胞病变。3.水稻来源的E蛋白免疫原性研究保护动物不受JEV的感染主要依靠体内抗体水平,尤其是中和抗体水平。用2中的方法免疫小鼠,动物实验表明,植物来源E蛋白诱导小鼠体内产生了高水平的乙型脑炎病毒特异性血清IgG抗体;中和抗体水平达到1:19.2,显著高于用大肠杆菌表达的E蛋白诱导的抗体水平（1:11.2）。口服免疫30天后,小鼠体内也产生了乙型脑炎病毒特异性血清IgG抗体;小肠洗液和体外培养液中检测到粘膜IgA抗体,且抗体水平显著高于口服大肠杆菌来源的E蛋白的小鼠,证明植物来源的E蛋白经口服诱导了粘膜免疫。以上结果明水稻作为一种生物反应器可以成功表达口蹄疫病毒P1蛋白和乙型脑炎病毒E蛋白,为进一步研究针对这两种病毒的可饲疫苗奠定了基础。下一步研究工作可以从以下两个方面进行:用分子生物学的方法提高外源蛋白在水稻中的表达量,比如使用种子特异性表达的启动子;从佐剂的使用方面提高水稻来源蛋白的口服免疫效果,比如使用CT或LT为口服佐剂。