研究背景：硬皮病是一种以广泛纤维化、血管改变和免疫异常为主要特点的自身免疫性疾病。硬皮病最常累及皮肤,引起胶原生成增加、细胞外基质沉积增加。此外,还可累及肺脏、心脏、肾脏、消化道等内脏器官,导致肺间质纤维化、肺动脉高压等严重并发症,10年生存率约为60%～90%。由于其病因不明,暂无特效治疗方法,特别是缺乏针对进行性纤维化的靶向治疗。随着对该病发病机制的深入研究,学者们认为细胞外基质生成增多是由成纤维细胞过度活化所致,在内皮细胞、淋巴细胞、巨噬细胞等细胞的互相作用下,通过细胞因子、趋化因子和生长因子等多种介质,成纤维细胞过度活化,形成恶性循环。阐明硬皮病的发病机制对于了解临床分型、指导治疗、判断预后至关重要。皮肤和脏器进行性纤维化是硬皮病的主要病理生理过程,转化生长因子(transforming growth factor, TGF)-β是其中的重要组成部分。TGF-β是成纤维细胞的强效趋化物,能使细胞外基质合成增多(如Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原等),使成纤维细胞合成纤连蛋白增多,调节细胞-基质粘附蛋白受体,调节蛋白产生(如纤溶酶原激活物或胶原酶原)。通过自身诱导,TGF-β能刺激成纤维细胞合成TGF-β,上调TGF-β受体的表达。TGF-β持续生成增多,引起细胞外基质进行性沉积,进而导致纤维化。TGF-β主要通过Smad家族转录激活因子实现信号传递,其中Smad3与其关系最为密切。在活化的TGF-β刺激下,Smad3被TGF-β受体Ⅰ激酶磷酸化,继而与Smad4结合形成复合物,进入细胞核,与Smad结合元件及转录因子相互作用,诱导编码细胞外基质的基因表达升高。microRNAs (miRNAs)是近年发现的一类约为22个核苷酸的非编码RNA分子,与mRNA3’端非翻译区种子序列配对,主要负向调控基因表达。如果配对完全或接近完全,靶mRNA将被完全降解。如果配对不完全,则与靶1mRNA形成复合物,抑制mRNA的翻译。最近数年间发现的1niRNA呈指数增长,由人类基因组编码的miRNA目前已超过千种。miRNA与多种自身免疫性疾病的发病相关,如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、干燥综合征和原发性胆汁性肝硬化。最新研究发现,miRNA可能参与硬皮病发病机制,但其具体定位及其靶基因有待进一步探讨。miRNA芯片技术是一种高通量miRNA筛查方法,可检测患者与正常对照中miRNA的差异表达。本研究拟采用miRNA芯片技术,筛选在硬皮病患者和正常人中差异表达的miRNAs,并通过生物信息学分析,寻找出与TGF-β/Smad促纤维化信号通路相关的miRNA,并采用real-time PCR、免疫组化等试验方法,从组织、细胞水平验证目标miRNA及其靶基因在硬皮病发病中的作用。开展本研究,有望为阐明miRNA在硬皮病发病机制中的作用提供实验依据,并为研发特异性抗纤维化靶向治疗提供目标miRNA。第一部分miRNA在硬皮病患者皮肤中的差异表达目的通过比较硬皮病患者与正常对照的miRNA表达谱,发现在硬皮病患者中具有差异表达的miRNAs。方法采集7例硬皮病患者与7例对照者的临床资料和皮肤样本,进行组织病理检查,并采用miRNA芯片技术分析具有差异表达的miRNAs。结果在7例硬皮病患者中,5例为弥漫性硬皮病,2例为局限性硬皮病,男性2例,女性5例,年龄为30-64岁,平均年龄49.0岁,平均病程16.6个月。对照组7例,其中男性4例,女性3例,年龄为21-58岁,平均年龄44.8岁。从硬皮病患者与对照者前臂取皮肤样本,分别进行病理检查、成纤维细胞培养和miRNA芯片分析。硬皮病患者的皮肤病理检查显示胶原过度沉积和深部纤维化。经miRNA芯片技术分析,发现在弥漫性硬皮病患者中,表达差异的miRNAs共有42个,其中25个表达上调,17个表达下降。在局限性硬皮病患者中,表达差异的miRNAs共有60个,其中42个表达上调,18个表达下降。21个miRNAs在弥漫性硬皮病和局限性硬皮病中均有表达差异,其中13个上调,8个下调。结论硬皮病患者与正常对照的皮肤组织具有不同的miRNAs表达谱。第二部分m i R-145在硬皮病TGF-β/Smad3通路中的作用及机制研究目的探讨miR-145在硬皮病TGF-β/Smad3通路中的作用及其机制。方法通过生物信息学方法筛选与TGF-β/Smad3通路相关的miRNA。采用real-time PCR检测miR-145在硬皮病患者和正常对照者的皮肤组织和皮肤成纤维细胞中的表达,免疫组化、real-time PCR检测Smad3蛋白和mRNA在硬皮病患者和正常对照者的皮肤组织和皮肤成纤维细胞中的表达,real-time PCR检测TGF-β刺激时硬皮病患者和正常对照者的皮肤成纤维细胞中miR-145和Smad3mRNA的表达。结果经过生物信息学分析,发现Smad3mRNA中含有miR-145结合的种子序列。对正常对照相比,miR-145在硬皮病患者的皮肤组织和皮肤成纤维细胞中表达均显著降低(P<0.05),Smad3mRNA在硬皮病皮肤组织和皮肤成纤维细胞中表达显著升高(P<0.05),Smad3蛋白在硬皮病皮肤组织中表达显著升高(P<0.05)。TGF-β刺激时,硬皮病成纤维细胞中miR-145显著升高,Smad3mRNA表达显著降低(P<0.05)。结论miR-145可能参与硬皮病TGF-β/Smad3促纤维化通路的信号转导。