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目的:膀胱癌（BC,bladder cancer）是指发生在膀胱黏膜上的恶性肿瘤。它也是泌尿系统中最常见的恶性肿瘤之一,它不仅会影响泌尿系统功能,而且膀胱癌极易复发,对患者的生存质量造成极大威胁。虽然目前针对膀胱癌的生物学特性的研究上,已经取得了诸多成就,然而,在对膀胱癌治疗上,目前仍主要局限于手术及化学治疗,在对膀胱癌生物学特性如增殖、转移并利用此种特性调节甚至治疗膀胱癌的研究却少之又少。在近期的研究中有越来越多的证据表明MCM（Minichromosome maintenance,微小染色体维持蛋白）家族在肿瘤的发生发展上,起到了至关重要的作用。目前已有报道证实在大多数人类癌症（例如结肠癌,肺癌,胃癌,肾癌和乳腺癌等）中MCM3基因均呈过表达状态。并且,MCM3被认为是一种参与细胞分裂的关键因子。环状RNA（circ RNA）可以通过充当mi RNA（micro RNA,小RNA）海绵,从而降低其靶向m RNA的能力来调节基因。然而在膀胱癌中,此条完整的调节路径却鲜有研究,因此,本文对circ RNA/mi RNA/MCM3通路在膀胱癌中对膀胱癌细胞生物学特性的影响以及其详细机制进行探索,为膀胱癌的临床治疗提供新的思路。方法:1.筛选及检测MCM3的上游mi RNA通过对Targetscan、mi RBase、mi RWalk等生信网站数据分析,预测出与MCM3m RNA有结合位点、保守且未在膀胱癌中被研究的mi RNA。再通过双荧光素酶报告基因（Luciferase）等实验证明MCM3与上游预测的mi RNA的结合。从我院的标本库中通过随机方法选出30对病理诊断明确的膀胱癌标本,再通过提取癌及相应癌旁组织中的总RNA及蛋白;培养T24、UMUC3、J82、5637这4种有代表性的膀胱癌细胞系及一种SV-HUC-1（上皮永生化）细胞,提取RNA及蛋白,通过PCR检测技术检测MCM3 m RNA及mi RNA表达量,利用蛋白免疫印迹试验（Western blot,WB）实验检测MCM3蛋白表达情况。分析MCM3及相应mi RNA在细胞中表达相关性。选取两种膀胱癌细胞系进行后续实验。2.明确mi RNA对MCM3的调控机制以及mi RNA在膀胱癌细胞系中的生物学功能对膀胱癌细胞系分别转染mi RNA模拟物/抑制物（mimics/inhibitor）后检测MCM3 m RNA及蛋白水平变化。再根据生信的预测位点,构建野生型及突变型双荧光素酶报告基因质粒,通过Luciferase实验来判定mi RNA与MCM3 m RNA 3’-UTR区是否有特异性结合。对膀胱癌细胞系转染mi RNA的mimics/inhibitor及NC对照,利用Ed U实验来检测转染后的膀胱癌增殖水平;用未经处理的Transwell小室来检测细胞转染后的转移能力;用经过基质胶处理过的Transwell小室来检测细胞转染后的侵袭能力。用回复实验检测mi RNA对膀胱癌细胞生物学功能实验的影响并证明此影响是通过调控MCM3来现在的。3.筛选及验证mi RNA的上游circ RNA利用RNAhybrid等生信网站预测出与目的mi RNA具有结合位点、保守且未在膀胱癌中被研究的circ RNA。再通过Luciferase等实验证明circ RNA是否与所研究mi RNA具有相同的结合位点。4.circ RNA在膀胱癌中的生物学功能及通过mi RNA对m RNA的调控在膀胱癌细胞系中转染CIRC-si RNA,利用Ed U实验来检测转染后细胞的增殖能力;利用未经处理的Transwell实验来检测细胞转染后的转移能力;用经过基质胶处理过的Transwell实验来检测细胞转染后的侵袭能力。回复实验证明circ RNA对膀胱癌细胞生物学功能实验的影响并证明此影响是通过调控mi R147a/MCM3来现在的。5.裸鼠成瘤进行膀胱癌细胞体内成瘤实验,我们选取周龄为4-6w品系为Balb/c的雌性裸鼠,每只鼠皮下注射100μl稳转MCM3过表达质粒/瞬转长效CIRC-si RNA后的UMUC3细胞,监测对比各组之间肿瘤生长情况。然后取所成的瘤体进行免疫组化,检测Ki-67及MCM3的表达变化判断circ RNA及MCM3对肿瘤增殖的影响。结果:1.MCM3在4种膀胱癌细胞系中的表达相较于对应的SV-HUC-1细胞呈高表达状态。MCM3在癌组织中的表达相于对相应的癌旁组织呈高表达状态。我们通过生信预测以及Luciferase实验发现,mi R147a与MCM3 m RNA有特异性结合位点,并且mi R147a可以抑制MCM3 m RNA以及MCM3蛋白表达。我们还发现mi R147a在膀胱癌组织中比对应的癌旁组织中表达量明显降低,在T24、UMUC3中较相应的SV-HUC-1细胞呈现表达量明显降低。2.在检测mi R147a对膀胱癌生物学特性影响的实验中发现,mi R147a可以明显抑制膀胱癌增殖、侵袭、转移能力。并且回复实验证明mi R147a是通过靶向调控MCM3的方式来影响膀胱癌细胞增殖、侵袭、转移等生物学特性的。3.生物信息学方法分析预测发现,hascirc0054123与mi R147a有特异性结合位点。通过Luciferase实验,RNA pulldown试验以及RNA免疫沉淀试验,证实了此结合位点。内源性抑制hascirc0054123可负向调控mi R147a升高。4.相较于对应的癌旁组织,hascirc0054123在膀胱癌组织中呈现高表达。体外实验证明,转染了CIRC-si RNA后可明显抑制膀胱癌细胞的增殖、侵袭、转移。在裸鼠体内实验中同样证实此种结果,注射长效化学修饰circ-si后,成瘤质量明显较control组明显减小。5.转染了CIRC-si RNA后可降低MCM3的表达,hascirc0054123与MCM3和表达量呈正相关。并且hascirc0054123调控MCM3的作用是通过竞争性结合mi R147a的方式实现。