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类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以滑膜组织肿瘤样增生、持续性滑膜炎症、骨侵蚀和进行性关节破坏为主要病理特征的慢性自身免疫性疾病。T/B淋巴细胞、巨噬细胞和成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLSs)等多种细胞都参与了RA的发病机制。滑膜组织中活化的FLSs通过分泌促炎因子,基质金属蛋白酶,趋化因子和细胞粘附分子等引起T细胞和B细胞在滑膜组织内聚集而加剧炎症反应。而这些聚集的炎症细胞可以分泌更多数量和各类的炎症因子和趋化因子导致更多的RA FLSs活化并促进其增殖和迁移的增加,从而使疾病的炎症反应进一步加重。因此,FLSs是RA疾病过程中的关键因素之一。虽然目前尚未完全明确RA的发病机制,但滑膜组织以及FLSs的增殖和迁移无疑在RA发病机制的炎症反应过程中起着至关重要的作用。因此,研究如何抑制RA中FLSs增殖和迁移以及炎症反应对于阐明疾病机制和治疗具有积极意义。骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs),是转化生长因子β(transforming growth factorsβ,TGF-β)超家族成员,它因为可以诱导骨髓和软骨的异位形成被命名。目前已经明确了BMPs不仅具有成骨作用,还参与了胚胎发育、器官形成以及多种疾病的发生发展过程。研究表明BMP3也对肿瘤等疾病发挥了重要的抑制作用。它不仅抑制了结直肠癌、胆管癌细胞的增殖,促进细胞凋亡,而且还抑制了博来霉素诱导的小鼠肺纤维化原代成纤维细胞的增殖和活化。更重要的是,有证据表明在CIA小鼠的滑膜中BMP3 m RNA的表达低于正常小鼠。但是在RA FLSs中BMP3的作用和调控机制尚未见研究报道。为了探讨BMP3在RA发病进程中对FLSs增殖迁移以及炎症因子分泌的调节作用和机制。本课题进行了如下的研究:1.BMP3在RA患者和AIA大鼠的膝关节滑膜和成纤维样滑膜细胞中表达下调本课题为研究BMP3在RA中是否发挥调控作用,分别收集了骨关节炎(osteoarthritis,OA)患者和RA患者的膝关节滑膜样本,采用苏木精-伊红(hematoxylin and eosin,HE)组织病理学染色实验和蛋白质印迹(western blot,WB)实验验证了样本的RA组织病理学和炎症因子高表达特征。采用免疫组织化学染色(immunohistochemistry,IHC),免疫荧光染色(immunofluorescence,IF),WB和qPCR等实验方法发现,以OA患者的滑膜和FLSs为对照,RA患者的滑膜和FLSs中BMP3的表达下调;本课题还通过给大鼠注射CFA诱导建立佐剂性关节炎(adjuvant-induced arthritis,AIA)模型。通过测量大鼠足爪肿胀和关节炎评分、酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)、HE染色、WB和q-PCR等实验方法确定大鼠AIA模型建立成功。同样采用IHC、IF、WB和qPCR等检测方法发现,与正常大鼠相比,AIA大鼠的滑膜组织和FLSs中BMP3的表达下调。2.BMP3-RNAi促进AIA FLSs增殖以及AIA FLSs和RA FLSs的迁移我们采用WB和q-PCR实验对AIA FLSs进行体外研究,结果发现BMP3-RNAi转染显著降低了AIA FLSs中BMP3的m RNA和蛋白表达水平,并且明显上调了C-Myc和Cyclin D1的m RNA和蛋白表达水平。本课题采用流式细胞计数仪通过细胞周期实验发现BMP3-RNAi转染可使AIA FLSs S+G2/M期的细胞数量显著增加,CCK8以及Ed U细胞增殖实验检测发现BMP3-RNAi转染可显著促进AIA FLSs的增殖。WB和q-PCR结果提示,BMP3-RNAi转染显著上调了AIA FLSs中MMP-3和MMP-9的m RNA和蛋白表达水平,而TIMP-1的m RNA和蛋白表达明显下调。通过Wound-healing和Transwell实验还发现BMP3-RNAi转染增加了AIA FLSs的迁移和侵袭能力。此外,采用10ng/m L TNF-α刺激AIA FLSs和RA FLSs后发现,BMP3-RNAi转染同样增加了TNF-α刺激的FLSs中MMP-3和MMP-9 m RNA和蛋白表达水平,并且下调了TIMP-1 m RNA和蛋白的表达水平。同时Woundhealing实验检测发现BMP3-RNAi转染同样促进了TNF-α刺激的FLSs的迁移。3.BMP3过表达质粒抑制AIA FLSs的增殖以及AIA FLSs和RA FLSs的迁移本实验中WB和q-PCR结果提示,BMP3过表达质粒(BMP3-PEX)转染AIA FLSs使BMP3的m RNA和蛋白表达水平显著升高,而且显著性下调了C-Myc和Cyclin D1在AIA FLSs内的m RNA和蛋白表达水平。此外,细胞周期实验发现BMP3-PEX转染AIA FLSs显著性抑制S+G2/M期细胞数量的增加,CCK8和Ed U细胞增殖实验检测发现BMP3-PEX转染显著抑制了AIA FLSs的增殖。WB和q-PCR结果发现,BMP3-PEX转染AIA FLSs显著下调MMP-3和MMP-9的m RNA和蛋白表达水平,上调了TIMP-1的m RNA和蛋白表达水平。同样Wound-healing和Transwell实验发现BMP3-PEX转染抑制了AIA FLSs的迁移和侵袭能力。此外,在本研究中我们同样用10ng/m L TNF-α刺激AIA FLSs和RA FLSs后发现,BMP3过表达质粒(BMP3-PEX和BMP3-pc DNA3.1)转染同样下调了TNF-α活化后的FLSs中MMP-3和MMP-9的m RNA和蛋白表达水平,上调了TIMP-1的m RNA和蛋白表达水平。同时Wound-healing实验发现BMP3-PEX和BMP3-pc DNA3.1转染同样抑制了TNF-α刺激的AIA和RA FLSs的迁移。4.BMP3-RNAi沉默BMP3促进FLSs中炎症因子的表达WB和q-PCR实验结果表明,BMP3-RNAi转染下调BMP3表达,使AIA FLSs中IL-6、IL-1β、IL-17A和TNF-α的蛋白和m RNA表达水平显著上调。而ELISA试剂盒检测发现BMP3-RNAi同样增加了AIA FLSs培养基上清中IL-6、IL-1β和TNF-α的含量。同样,q-PCR实验发现BMP3-RNAi转染显著增加了AIA FLSs中粘附因子VCAM-1和趋化因子CCL-2、CCL-3 m RNA的表达。在本阶段研究中我们同样用10ng/m L TNF-α刺激了AIA FLSs和RA FLSs。WB和q-PCR结果表明,BMP3-RNAi同样增加了TNF-α刺激的AIA FLSs和RA FLSs中IL-6、IL-1β、IL-17A和TNF-α蛋白和m RNA的表达。q-PCR结果表明BMP3-RNAi上调了TNF-α刺激的AIA FLSs和RA FLSs中VCAM-1、CCL-2和CCL-3 m RNA的表达。5.过表达质粒上调BMP3抑制了FLSs中炎症因子的表达WB和q-PCR实验结果表明,BMP3过表达质粒上调BMP3表达,显著抑制了AIA FLSs中的IL-6、IL-1β、IL-17A和TNF-α蛋白和m RNA的表达。而ELISA试剂盒检测发现BMP3过表达质粒同样减少了AIA FLSs培养基上清中IL-6、IL-1β和TNF-α的含量。同样,q-PCR实验发现BMP3过表达质粒转染显著下调了AIA FLSs中粘附因子VCAM-1和趋化因子CCL-2、CCL-3 m RNA的表达。同样,WB和q-PCR结果表明BMP3过表达质粒下调了TNF-α刺激下的AIA和RA FLSs中IL-6、IL-1β、IL-17A和TNF-α蛋白和m RNA的表达。q-PCR结果表明BMP3过表达质粒也减少了TNF-α刺激的AIA和RA FLSs中VCAM-1、CCL-2和CCL-3 m RNA的表达。6.BMP3对FLSs的调控作用可能与TGF-β1/smad信号通路相关WB实验结果显示,与正常大鼠的FLSs相比,AIA FLSs中p-Smad2表达量明显升高,BMP3-RNAi转染的AIA FLSs与对照组相比p-Smad2表达量明显升高。而过表达质粒BMP3-PEX转染显著地下调了p-Smad2在AIA FLSs中的蛋白表达。在后续实验中我们同样用10ng/m L TNF-α刺激AIA FLSs和RA FLSs后发现,pSmad2蛋白表达水平与未刺激组相比显著升高,并且BMP3-RNAi转染增加了pSmad2蛋白表达水平,BMP3过表达质粒降低了p-Smad2表达水平。以上结果提示,BMP3可能通过TGF-β1/smad信号通路调节FLSs的增殖和迁移。4.BMP3过表达腺病毒对AIA大鼠的影响在大鼠的体内实验部分,我们将腺病毒ad-BMP3注射到AIA大鼠的膝关节腔内,2周后大鼠活体成像实验结果表明腺病毒在大鼠体内成功复制。IF、IHC以及WB实验表明在大鼠滑膜组织中BMP3过表达成功。大鼠足爪肿胀度测量和关节炎指数评分、HE染色结果证实ad-BMP3减轻了AIA的严重程度及滑膜组织增生和炎性浸润。同时WB检测还发现,ad-BMP3抑制了大鼠滑膜组织中IL-6、IL-1β、IL-17A和TNF-α的表达。而ELISA结果表明ad-BMP3减少了AIA大鼠血清中IL-6、IL-1β和TNF-α的含量。