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支气管哮喘(哮喘)是一种异质性、慢性呼吸道炎症性疾病,表现为多种炎性细胞在气道组织浸润并分泌多种炎症介质和细胞因子,引起气道平滑肌收缩、气道上皮粘液分泌增加、血浆渗出、粘膜水肿及气道上皮损伤,导致气道高反应性和气道炎症。近年来,针对哮喘的异质性,逐渐开展了对其表型的研究,2009年的哮喘防治指南(GINA)第一次提出“表型”这一概念,并提出基于表型的分类将有助于哮喘的治疗及预后的判断。哮喘表型的分类为哮喘的个体化治疗提供了可能,其中炎症细胞表型基于主要炎症细胞的不同,将哮喘分为嗜酸粒细胞型、混合粒细胞型、中性粒细胞型及粒细胞缺乏型四种表型;哮喘临床表型基于气道炎症机制、病理、病理生理和临床表现等方面的不同,将哮喘分为儿童哮喘、成人时期发病的哮喘、咳嗽变异性哮喘和典型哮喘、嗜酸性细胞和非嗜酸性细胞哮喘、重症哮喘等。各种哮喘表型的发病特点、病理生理机制及治疗方案各不相同,因此深入探讨哮喘表型病理生理机制,具有十分重要的临床意义。骨膜素(Periostin)又称为成骨细胞特异性因子2,是一种细胞外基质蛋白,在哮喘的组织重塑中起着重要的作用,而气道重塑是难治性哮喘的典型病理表现。有研究表明骨膜素是哮喘TGF-β及IL-4/IL-13通路的下游蛋白,TGF-β这条通路通常被认为对皮质醇不敏感,IL-4/IL-13通路也是TH2型哮喘的经典通路。基于骨膜素在气道重塑及TH2型哮喘中的作用,有学者认为其可作为TH2型哮喘或组织重塑的生物标志物,然而目前对骨膜素的研究多局限于TH2、非TH2型哮喘之间,却缺乏针对其在痰上清的表达及与哮喘表型关系的系统研究。肺泡巨噬细胞是嗜酸粒细胞型哮喘及粒细胞缺乏型哮喘中的优势细胞,现有研究发现部分难治性哮喘可能与巨噬细胞有关。已有研究表明巨噬细胞可能与骨膜素之间存在紧密的联系,即巨噬细胞可能分泌骨膜素,而骨膜素又可以作用于巨噬细胞及其它炎性细胞而加重哮喘症状,然而巨噬细胞能否分泌骨膜素尚无定论。因此,基于上述背景本研究以招募的哮喘患者及人外周血的单核细胞系(THP-1)为研究对象,探讨长春地区哮喘患者炎症细胞表型分布特点及可能发病机制,研究痰上清骨膜素在重症哮喘、哮喘炎症细胞表型中的作用,探讨骨膜素与哮喘表型关系中巨噬细胞的角色,为哮喘的个体化诊断、为靶向治疗哮喘药物的开发提供科学依据。方法1、根据诱导痰修正方案随机对161例哮喘患者和21例健康志愿者进行痰诱导、痰涂片、根据国际上通用的哮喘炎症细胞表型判定标准确定哮喘炎症细胞表型。采集哮喘患者基本信息,哮喘控制问卷(ACQ)、哮喘控制测试问卷(ACT)、成人哮喘生命质量量表(AQLQ)、医院焦虑抑郁(HAD)等哮喘相关问卷,并行血常规、肺功能、呼出气NO测试(Fe NO)等检查。2、通过ELISA方法检测痰上清及血清炎症介质表达水平,包括骨膜素、白介素1β(IL-1β)、白介素5(IL-5)、白介素6(IL-6)、白介素8(IL-8)、白介素9(IL-9)。比较哮喘组与健康对照组、重症哮喘组与非重症哮喘组、哮喘炎症细胞表型内部临床资料、肺功能、Fe NO、临床用药、炎症介质表达水平差异。3、应用免疫荧光技术检测痰涂片中骨膜素抗原的表达。应用real time-PCR检测人外周血的单核细胞株向巨噬细胞转化后,骨膜素基因表达情况。结果1、研究对象特征及骨膜素在哮喘患者中的表达:(1)受试者为179名哮喘患者及24名健康志愿者,根据国际上通用的诱导痰技术标准共161名患者及21名健康志愿者诱导痰涂片合格;(2)哮喘组与健康对照组相比在年龄、性别、体重指数、吸烟指数等方面无明显差异;(3)哮喘组FEV1、FEV1%预计值均较健康对照组明显偏低,而呼出气NO(Fe NO)哮喘组较健康对照组明显偏高(P<0.05);(4)与健康对照组相比,哮喘组痰涂片中有明显增高的炎细胞总数、嗜酸性粒细胞数;(5)哮喘组痰上清骨膜素水平[28(12,36)pg/ml]较健康对照组明显偏高[7(4,20)pg/ml],差异显著(P<0.05)。此外,血清骨膜素水平[12(7,18)pg/ml]也明显较健康对照组[5(4,8)pg/ml]偏高(P<0.05)。痰上清和血清骨膜素水平在哮喘患者中表达增高,其对于哮喘患者的初步诊断和鉴别诊断具有一定价值。2、重症哮喘组特征及骨膜素表达情况:(1)重症哮喘组与非重症哮喘组在年龄、性别、体重指数、吸烟指数等方面均无明显差异;(2)重症哮喘组与非重症哮喘组相比FEV1、FEV1%明显偏低、Fe NO明显偏高,且差异均具有统计学意义(P<0.05);(3)重症组具有较非重症组偏高的医院焦虑/抑郁及哮喘控制问卷评分,偏低的哮喘控制测试问卷及成人哮喘生命质量量表评分;(4)重症哮喘组与非重症哮喘组相比痰上清骨膜素水平明显偏高[28(19,40)vs24(5,32)pg/ml,P<0.05],血清骨膜素水平虽有所偏高,但不具有统计学意义,说明痰上清骨膜素水平能够较好的提示哮喘的严重程度。3、哮喘炎症细胞表型特征及骨膜素表达情况:(1)根据国际上通用的哮喘炎症细胞表型判定标准,将161名哮喘患者分为4种表型:嗜酸粒细胞型(EA)65例(36.3%),粒细胞缺乏型(PA)88例(49.2%),中性粒细胞型(NA)3例(1.7%),混合粒细胞型(MA)5例(2.8%);(2)中性粒细胞型与混合粒细胞型、粒细胞缺乏型、嗜酸粒细胞型相比,年龄偏大,男性偏多,体重指数偏大,但无统计学意义;(3)中性粒细胞型与混合粒细胞型、粒细胞缺乏型、嗜酸粒细胞型相比FEV1%偏低,但无统计学意义;(4)混合粒细胞型与中性粒细胞型、粒细胞缺乏型及嗜酸粒细胞型相比,焦虑/抑郁评分明显偏高(P<0.05);粒细胞缺乏型具有最高的哮喘控制试验评分及成人哮喘生命质量评分(P<0.05);(5)痰上清骨膜素水平以嗜酸粒细胞型为最高[30(20,38)pg/ml],其次依次为粒细胞缺乏型[20(8,34)pg/ml]、混合粒细胞型[14(7,25)pg/ml],差异有统计学意义(P<0.05);血清骨膜素水平以嗜酸细胞型为最高[16(9,26)pg/ml],其次依次为粒细胞缺乏型[9(7,17)pg/ml],混合粒细胞型[8(6,11)pg/ml],差异有统计学意义(P<0.05),这说明骨膜素与嗜酸粒细胞型哮喘关系最为密切。4、骨膜素与炎症因子、Fe NO、吸入用药的关系:(1)痰上清骨膜素增高水平与痰IL-5水平(r=0.714、P<0.05)、痰嗜酸细胞数(r=0.100、P<0.05)呈正相关;(2)血清骨膜素水平与Fe NO(r=0.054、P<0.05)呈正相关;(3)吸入ICS组患者血清骨膜素水平最高[13(6,19)pg/ml],其次依次为ICS/LABA组[9(7,17)pg/ml]、未用组[9(6,14)pg/ml],差异具有统计学意义(P<0.05);而痰上清中骨膜素水平也呈现相同趋势,但差异不具有统计学意义。说明骨膜素与嗜酸性炎症关系密切且血清骨膜素水平易受吸入ICS及LABA影响。5、巨噬细胞抗原及基因表达情况:(1)免疫荧光在痰涂片巨噬细胞中检测到了骨膜素抗原表达。(2)Real time-PCR结果显示通过佛波酯来诱导人单核细胞系向巨噬细胞转化后再加入IL4+IL13诱导巨噬细胞向M2极化后,细胞内骨膜素基因m RNA表达水平较未极化的巨噬细胞显著增高约10倍(P<0.05)。结论1、长春地区哮喘患者炎症细胞表型以粒细胞缺乏型为主,哮喘炎症细胞表型间临床表现、肺功能、哮喘相关问卷、炎细胞浸润等存在明显不同。提示不同炎症细胞表型病理生理过程不同,体现了哮喘患者的异质性,这种表型分类为研究哮喘分子发病机制奠定了基础,也为精准治疗提供了科学依据。2、长春地区哮喘患者痰上清及血清骨膜素水平在嗜酸粒细胞型哮喘及重症哮喘明显偏高,这与国外研究报道结果一致。证实了骨膜素可作为嗜酸粒细胞型哮喘的生物标志物并可以较好的评估哮喘的严重程度。3、巨噬细胞能够分泌骨膜素,且发生M2极化后其表达量明显增高。这有助于进一步探讨巨噬细胞在哮喘表型中的作用,为哮喘的分型诊断及治疗提供了新的研究方向。