论文部分内容阅读
目的:血清骨特异性碱性磷酸酶(bone-specific alkaline phosphatases,BAP)是一种新的慢性肾脏病-矿物质和骨异常(chronic kidney disease-mineral and bone disorder,CKD-BMD)生物学标志物,本研究主要探讨维持性血液透析(maintenance hemodialysis,MHD)患者中血清BAP水平及其影响因素,以及BAP与心血管钙化和预后的相关性。进一步探讨尿毒症高磷诱导的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)钙化的机制。方法:(1)入选2012年7月1日于上海交通大学医学院附属瑞金医院血液透析中心的MHD患者,年龄18-80周岁,透析龄在3个月以上。收集患者临床资料、透析前血生化指标,药物治疗情况;收集患者透析前血清和35例健康志愿者血清,采用Micro Vue BAP免疫测定法(Quidel,San Diego,CA)检测血清BAP水平,分析透析患者血清BAP的水平及其影响因素;(2)心脏超声和腹部侧位片评估患者心血管钙化情况,分析血清BAP水平与心脏瓣膜钙化和腹主动脉钙化的相关性。随访至2016年7月1日,记录患者失访、肾移植以及预后情况,进一步分析BAP与心血管死亡和全因死亡的相关性;(3)体外培养大鼠原代VSMCs,利用细胞技术试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)检测不同浓度磷刺激条件下VSMCs增殖情况。高磷培养基(3mmol/L)刺激细胞3天或6天,茜素红染色评估VSMCs钙化情况,碱性磷酸酶(alkaline phosphatases,ALP)试剂盒和钙含量试剂盒分别检测细胞内ALP活性和钙含量,实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative realtimepolymerase chain reaction,RT-PCR)和蛋白质免疫印迹法(western blot,WB)检测钙化相关蛋白骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)、Runt相关转录因子2(runt related transcription factor 2,Runx2)和Klotho表达的变化。结果:(1)共入选219例MHD患者,中位年龄为58.00(48.00~67.00)岁,中位透析龄41.00(21.00~76.00)月,10.96%的患者合并有糖尿病。MHD患者中位BAP水平为19.67(14.83-26.98)U/L,女性透析患者BAP水平与女性健康志愿者无显著差异,但男性透析患者明显低于男性健康志愿者。MHD患者中,男性透析患者BAP水平显著低于女性患者。相关分析结果显示总碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、甲状旁激腺素、BAP/ALP、透析龄、单室尿素清除率(single-pool Kt/V,sp Kt/V)、总铁结合力与BAP正相关,血碳酸氢根水平、透析后平均收缩压与BAP负相关。多因素Logistic回归结果显示服用女性、服用β-受体阻滞剂、高甲状旁腺激素水平是血清BAP水平的独立影响因素。(2)179例完成心超检查的MHD中,20(11.17%)例患者有二尖瓣钙化,55(30.73%)例患者有主动脉瓣钙化;191例MHD患者完成腰椎侧位平片检查,123(64.40%)例患者有腹主动脉钙化。合并二尖瓣钙化组患者BAP水平更高,合并腹主动脉钙化组患者BAP/ALP水平更低。随访4年,共计60例(26.67%)患者死亡,其中心血管事件死亡28例。Kaplan-Meier分析发现BAP/ALP最低组患者全因死亡率和心血管死亡率最高。COX回归分析发现BAP/ALP最低组全因死亡率、心血管死亡率分别是最高组患者的2.52和2.89倍。但经多因素(包括性别、年龄、透析龄、合并糖尿病)校正后,BAP/ALP比值不是全因死亡或心血管死亡的独立影响因素。(3)培养基磷浓度升高抑制VSMCs增殖;高磷刺激VSMCs6天后,钙化结节明显形成,细胞内钙含量显著增加,成骨相关蛋白BMP-2、Runx2的m RNA水平和蛋白水平均表达增加,而Kotho的m RNA水平和蛋白水平均表达下降。结论:(1)女性、服用β-受体阻滞剂、高甲状旁腺激素水平的透析患者血清BAP水平更高。(2)BAP与MHD患者心血管钙化相关,BAP/ALP比值较单纯BAP更能预测患者全因和心血管死亡风险。(3)高磷导致VSMCs钙化形成和表型转换可能是通过下调Klotho的表达而刺激BMP-2、Runx2表达的过程。