1研究背景及目的　　贵州省燃煤污染型地方性砷中毒（以下简称燃煤型砷中毒）是我国特有的一种地球化学性疾病，以肝脏和皮肤损害为主，肝硬化腹水为其主要死亡原因之一。燃煤型砷中毒肝损伤具有发病率高、死亡率高和病情严重等特点，且燃煤砷在肝脏有较强的蓄积性，停止接触后，其所致肝损伤仍能继续发展。毒作用机制不明和缺乏有效的治疗药物是其防治工作的瓶颈与难点，也是亟待解决的关键问题。氧化应激是燃煤型砷中毒肝损伤的主要机制之一，但机制尚不完全清楚。核因子-E2-相关因子-2（Nrf2）是调节氧化应激反应的重要核转录因子，生理状态下，Nrf2被Kelch样ECH联合蛋白1(Keapl)锚定在胞浆而处于非活性状态；应激状态下，Nrf2与Keapl解偶联后进入细胞核，结合小Maf蛋白形成异二聚体，然后再与抗氧化反应元件（ARE）结合，上调抗氧化酶和II相解毒酶表达，增强细胞解毒及抗氧化能力。蛋白激酶 C(PKC)可通过磷酸化 Nrf2的Ser40，促进Nrf2发生核转位后激活，介导细胞抗氧化反应。有报道，PKC-Nrf2-ARE通路与肝脏疾病的发生发展密切相关，且该通路的核心因子 Nrf2被报道在体外实验和动物实验中与饮水型砷中毒肝损伤有关。PKC-Nrf2-ARE通路与砷中毒肝损伤的关系，国内外尚未见报道。因此，本研究充分利用我省特有的燃煤型砷中毒病型资源，同时结合动物实验，从酶学、mRNA转录和蛋白表达3个水平，探讨PKC-Nrf2-ARE通路在燃煤型砷中毒肝损伤中的作用，为深入了解砷的毒作用机制及改进地方性砷中毒的预防和控制措施提供新的思路和方向。　　缺乏有效的治疗药物是地方性砷中毒防控工作至今尚未取得突破进展的瓶颈问题。尽管众多学者在此方面做了诸多探索，但迄今为止仍无有效的治疗药物。银杏是一种古老的植物药，富含黄酮类和萜类内酯，具有很强的抗氧化和保肝作用。课题组前期采用银杏叶片治疗燃煤型砷中毒肝损伤初见成效，但未对其干预机制进行深入探讨。国内外研究报道，银杏叶片的抗氧化作用与其调控PKC-Nrf2-ARE通路有关。本研究在人群和动物机制研究基础上，针对砷中毒肝损伤的严峻形势及目前仍无有效药物治疗砷所致肝损伤的紧迫现状，探索银杏叶片对砷中毒肝损伤的干预作用，并从 PKC-Nrf2-ARE通路的角度探讨其作用机制，为寻找有效的砷中毒预防和治疗措施提供思路和依据。　　2对象与方法　　2.1调查点及调查对象的选择以贵州省兴仁县交乐村燃煤型砷中毒病区为调查点，经健康体检确定133例砷暴露者为砷暴露组，按《地方性砷中毒诊断标准》(WS/T211—2001)分为病区非病人组（25例）和病例组（108例），由于《地方性砷中毒诊断标准》中无肝损伤判断标准，因此病例组参照《职业性中毒性肝病诊断标准》(GBZ59-2010)分为轻度肝病组（43例）和中重度肝病组（27例），其余病例为无明显肝病组(38例)；以相邻约13 km非燃用高砷煤且生活习惯及经济状况与病区调查点相似的某村34名居民为对照组。　　2.2砷中毒大鼠模型的建立健康断乳Wistar大鼠30只，体重80～100g，随机分为正常对照组、饮水型砷中毒组、低、中、高砷粮食污染组。正常对照组常规喂养3个月，模型组分别给予10mg/kg As2O3水溶液、25mg/kg、50mg/kg和100mg/kg含砷饲料染毒3个月。　　2.3银杏叶片干预模型的建立健康断乳Wistar大鼠30只，体重80～100g，随机分为正常对照组、单纯银杏叶片组、饮水型砷中毒组、高砷粮食污染组和银杏叶片治疗组。正常对照组常规喂养4.5个月，单纯银杏叶片组常规喂养3个月后，按25mg/kg.bw灌胃给予银杏叶片，每周6次，持续1.5个月；其余各组同2.2染砷3个月后，常规喂养1.5个月，银杏叶片治疗组常规喂养时，同单纯银杏叶片组进行干预给药。　　2.4观察指标及检测方法　　2.4.1大鼠一般情况和体重变化观察　　2.4.2砷负荷检测采用氢化物发生-电感耦合等离子体发射光谱法(HG-ICP-OES)测定尿砷、发砷和肝砷含量。　　2.4.3血清肝功能指标检测采用化学比色法测定丙氨酸氨基转移酶（ALT）、谷胱甘肽硫转移酶（GST）和胆碱酯酶（CHE），酶循环法测定总胆汁酸（TBA），重氮试剂比色法测定γ-GT，溴甲酚氯法测定白蛋白（ALB）。　　2.4.4大鼠肝脏病理组织形态学和超微结构检查采用HE染色和铅铀双重染色，光镜和透射电镜分别观察肝脏病理组织形态学和超微结构改变。　　2.4.5血清和肝组织匀浆氧化应激指标检测采用硫代巴比妥酸比色法测定丙二醛（MDA）含量，二-盐酸-N-（1-萘基）-乙烯二棕比色法测定巯基（-SH）含量，黄嘌呤氧化酶法测定铜锌超氧化物歧化酶（CuZn-SOD）活力，二巯双硝基苯甲酸还原法测定谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）和硫氧还蛋白还原酶（TrxR）活力。　　2.4.6外周血和肝组织PKC-Nrf2-ARE通路相关基因表达检测采用实时荧光定量PCR法（qPCR）检测PKCδ、Nrf2、Keap1、Cu-ZnSOD、GPx1和TrxR1 mRNA表达。　　2.4.7大鼠肝组织PKC-Nrf2-ARE通路相关基因蛋白表达检测用免疫组化检测大鼠肝组织pPKCδ、Nrf2、pNrf2、Keap1、Cu-ZnSOD、GPx1和TrxR1蛋白表达；免疫印迹（Western blotting）检测胞浆和胞膜中pPKCδ，胞膜和胞核中Nrf2和pNrf2蛋白表达。　　3结果　　3.1人群研究结果：①燃煤砷暴露人群存在不同程度的肝损害，氧化应激是肝损伤的主要原因之一；②砷可能通过上调Nrf2的转录表达水平，增强Cu-ZnSOD和GPx1转录表达，参与燃煤型砷中毒肝损伤的发生发展；同时，砷也可下调Keap1 mRNA表达和TrxR1 mRNA表达而使其酶活力降低，调控燃煤型砷中毒肝损伤的发生发展。　　3.2动物实验结果：①砷可导致大鼠发生肝损伤，氧化应激可能是砷中毒大鼠肝损伤的主要原因；②砷可诱导Nrf2转录表达和蛋白表达上调；还可增加pPKCδ蛋白表达和DAG含量，促进pPKCδ发生膜转位后磷酸化Nrf2，促使其发生核转位后增强Cu-ZnSOD和GPx1mRNA表达；③砷可能通过影响基因的转录后调控机制，使Cu-ZnSOD和GPx1蛋白表达和酶活力降低，参与砷中毒肝损伤的发生发展；④砷可引起TrxR1转录表达、蛋白表达和酶活力降低而调控砷中毒肝损伤的发生发展。　　3.3银杏叶片干预实验结果：①银杏叶片可在一定程度上缓解砷对大鼠的毒性效应，改善砷对大鼠肝脏的损伤程度，其作用与抗氧化应激有关；②银杏叶片可降低Keap1蛋白表达，促使Nrf2发生核转位，增强Cu-ZnSOD和GPx1 mRNA表达及部分逆转砷对Cu-ZnSOD和GPx1的转录后调控作用，增加其蛋白表达和酶活力，从而改善砷中毒大鼠肝损伤。　　4结论　　4.1砷可诱导氧化应激，激活 PKC-Nrf2-ARE抗氧化通路，增强 Cu-ZnSOD和GPx1基因表达；　　4.2砷可影响基因的转录后调控机制，使Cu-ZnSOD和GPx1蛋白表达和酶活力降低，参与砷中毒肝损伤的发生发展；　　4.3砷可降低TrxR1 mRNA表达、蛋白表达和酶活力，调控砷中毒肝损伤的发生发展；　　4.4银杏叶片可促使Nrf2发生核转位，部分逆转砷对Cu-ZnSOD和GPx1蛋白表达及酶活力的影响，改善砷中毒肝损伤。