【摘 要】
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马氏珠母贝（Pinctada fucata martensii）是我国人工海水育珠的主要珍珠贝之一,而植核育珠技术是人工育珠的核心环节。目前,学者们运用多组学技术对植核后的免疫应答机制进行了多方面的研究,而关于蛋白质翻译后修饰在植核免疫的相关研究较少。其中,乙酰化修饰作为蛋白质翻译后修饰中的一种,在生物体转录调控、信号通路调控、蛋白质稳定性调控等多个过程行使功能。本研究采用在珍珠贝体内注射广谱赖氨
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马氏珠母贝（Pinctada fucata martensii）是我国人工海水育珠的主要珍珠贝之一,而植核育珠技术是人工育珠的核心环节。目前,学者们运用多组学技术对植核后的免疫应答机制进行了多方面的研究,而关于蛋白质翻译后修饰在植核免疫的相关研究较少。其中,乙酰化修饰作为蛋白质翻译后修饰中的一种,在生物体转录调控、信号通路调控、蛋白质稳定性调控等多个过程行使功能。本研究采用在珍珠贝体内注射广谱赖氨酸去乙酰化酶抑制剂（Lysine deacetylase inhibitor,KDI）混合物,从分子、生化以及养殖指标等水平分析提高蛋白质乙酰化修饰水平对珍珠贝植核的影响;利用TMT标记和Kac亲和富集技术,对马氏珠母贝植核后12 h鳃组织的蛋白质进行乙酰化修饰组学分析,对显著变化的差异修饰位点和差异蛋白进行生物信息学分析;通过平行反应监测（Parallel Reaction Monitoring,PRM）验证乙酰化修饰组学结果,运用蛋白印迹（Western blotting,WB）技术检测植核后乙酰化修饰程度的时序变化,并对部分差异蛋白基因进行了基因克隆以及生物信息学分析,实验结果如下:（1）注射KDI混合物后,HDAC 6/10以及2个Sir2家族成员基因表达都出现显著下调,WB结果表明72 h出现总蛋白的乙酰化修饰水平上调;免疫相关因子IRAK1、IL-17、NF-κB和Caspase 2在12 h表达都显著上调,IκK在48 h表达显著上调,TRAF3在48 h表达显著下调;抗氧化酶CAT、POD和GSH-px的酶活力都在12 h出现显著上调;实验组（注射KDI+植核）相比对照组（注射DMSO+植核）和空白组（只植核）60 d的留珠率显著提高。这些结果综合表明,12 h可能是乙酰化修饰参与植核免疫应答的关键时间点,提高乙酰化修饰水平或许可以提高施术贝的免疫活力,并帮助其度过植核后的困难时期。（2）植核后12 h乙酰化修饰组学:一共鉴定到1212个蛋白上的2107个乙酰化修饰位点;对乙酰肽段的保守基序分析发现乙酰化修饰存在物种保守性,以及在珍珠贝植核免疫反应中也存在一定的位点偏好性;一共鉴定到55个差异修饰位点,对差异修饰蛋白进行KOG分类发现,上调和下调差异修饰蛋白对应的KOG簇并不一致,差异修饰蛋白的乙酰化/去乙酰化可能与其行使的功能相关,其中与细胞骨架相关的蛋白尤其是肌球蛋白重链多个位点发生去乙酰化,可能与植核手术有关;在KEGG中“烟酸和烟酰胺代谢”、“心肌收缩”和“脂肪酸降解”等通路被显著富集,表明新陈代谢过程的调节对珍珠贝植核免疫应答至关重要,以及乙酰化修饰可能与植核后的修复损伤有关。（3）对乙酰化修饰组学数据进行PRM验证,结果表明组学数据准确可靠;对植核后不同时间点鳃组织总蛋白的乙酰化程度进行WB分析,结果表明珍珠贝植核后发生了乙酰化修饰的变化;对差异修饰蛋白Pm NFκBIZ、Pm Pdhb和Pm Tktl2使用c DNA末端快速扩增技术（rapid amplification of c DNA ends,RACE）技术获得其基因序列全长,并进行生物信息学分析;三个基因的氨基酸序列在进化上具有一定的保守性,并且聚在同一支进化树的具有相同的motif序列;对作用于差异修饰位点的乙酰转移酶进行预测,表明Pm Tktl2和Pm Pdhb可能存在非酶促乙酰化修饰现象。综上所述,乙酰化修饰参与植核后的免疫应答,并且这些差异修饰蛋白包含细胞骨架、代谢和免疫等多个方面,这将为关键蛋白的功能研究提供一个新的思路,并为深入分析乙酰化修饰在珍珠贝植核免疫中的作用机制提供重要的研究基础。
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