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目的:从菲律宾蛤仔全脏器中提取得到糖胺聚糖,对其抗肿瘤作用进行研究,并从增强机体免疫力方面对其抗肿瘤作用的机理进行初步的探讨。
方法:1.采用双酶水解法提取菲律宾蛤仔糖胺聚糖粗品(CRG),DEAE-52纤维素纯化得到菲律宾蛤仔糖胺聚糖纯品(RG)。2.采用最大耐受量实验对CRG的毒性进行初步的检验。3.采用MTT法检测CRG和RG对体外培养的人肝癌Bel7402细胞的抑制作用,并探讨其对常用抗肿瘤药5-氟尿嘧啶的增敏作用;建立S<,180>和艾氏腹水瘤(EAC)小鼠模型,检测CRG对体内培养的S<,108>肉瘤的抑制作用及对荷EAC小鼠的腹围和生存天数的影响。4.采用免疫器官指数法、碳粒廓清实验和腹腔巨噬细胞吞噬中性红实验检测CRG和RG增强机体非特异性免疫功能的作用;通过脾细胞增殖实验检测CRG和RG对小鼠脾淋巴细胞的增殖作用;建立免疫小鼠模型,检测CRG对小鼠迟发型变态反应能力的影响。建立免疫小鼠模型,分别采用比色法检测CRG对小鼠血清溶血素和抗体生成细胞数的影响。5.对RG进行成分测定,采用高效凝胶渗透色谱法检测其分子量,并用红外光谱法检验其所含有的特征基团。
结果:1.粗提得到糖胺聚糖粗品的得率为0.9%~1.0%,其GAG含量为32.0%。DEAE-52纤维素柱层析采用0.5mol/LNaAc缓冲液,1.5mol/LNaCl,流速12mL/h梯度洗脱,得到单一组分,其GAG含量为60.3%。2.最大耐受量实验显示CRG在9g/kg范围内安全无毒。3.(1)CRG、RG对体外培养人肝癌Bel7402细胞的生长有抑制作用,且RG的抑制效果优于CRG。除50和100μg/mLCRG作用24h对5-Fu的抗肿瘤作用分别显示单纯相加作用和协同增强作用外,其它组CRG和RG均对5-Fu的抗肿瘤作用显示拮抗作用。(2)CRG对小鼠体内S<,180>肉瘤的生长具有显著的抑制作用。200mg/kg剂量组抑制率达到62.2%(P<0.001)。(3)CRG对小鼠体内艾氏腹水瘤细胞有一定的抑制作用,能显著延长荷瘤小鼠的生存天数,减小小鼠腹围。200mg/kg剂量组CRG对小鼠的生命延长率为22.81%(P<0.05)。4.(1)50mg/kg低剂量CRG对CY造成的胸腺损伤和肿瘤引起的小鼠脾指数不正常升高有修复作用(P<0.05),对CY组荷瘤小鼠免疫系统有损坏作用,胸腺指数降低(P<0.001),脾指数进一步上升(P<0.05)。100、150mg/kgCRG与CY合用对小鼠胸腺指数有更强的损伤作用(P<0.05)。三个剂量组对CY造成的脾指数下降有不同程度的提高(P<0.05)。100和200μgRG可提高小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红的能力。(2)50、100和200μg RG对小鼠脾细胞增殖能力均有明显增强作用,刺激指数分别达到1.39(P<0.01)、1.43(P<0.001)、1.42(P<0.001)。50mg/kgCRG对小鼠迟发型变态反应能力有明显增强作用(P<0.05)。(3)50、100mg/kgCRG能提高小鼠血清溶血素含量(P<0.05);100、150mg/kgCRG免疫抑制治疗组小鼠血清溶血素含量高于CY组(P<0.05),CRG治疗组与生理盐水组相比,血清溶血素含量均较高(P<0.05)。CR.G能提高小鼠抗体生成数(P<0.001),且呈现良好的量效关系。免疫抑制治疗组小鼠抗体生成细胞数趋于正常,且50、100mg/kgCRG治疗组小鼠抗体生成细胞数高于生理盐水组(P<0.001)。5.RG以氨基己糖和己糖醛酸为主,中性己糖含量很少,其中含有大量的硫酸基。高效凝胶渗透色谱结果显示RG分子量在35220左右。红外光谱图显示,菲律宾蛤仔糖胺聚糖具有-OH、-NH、-COO<->、-SO<,3>H、C-O-C等糖胺聚糖的特征基团。
结论:菲律宾蛤仔糖胺聚糖具有良好的抗肿瘤活性和增强机体免疫功能活性,其抗肿瘤作用可能通过增强集体免疫功能而实现;理化性质分析表明,菲律宾蛤仔糖胺聚糖是一种具有理化性质特异性的糖胺聚糖,其良好的生理活性有可能与其成分和结构有关。