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本文从进化的角度,研究从低等动物到高等动物体液中肌酸激酶CK与病原菌的关系,发现不同进化层次动物体液CK与病原菌相互作用的机制完全不同。在低等动物,CK既是机体的一个免疫防御因子,同时也是病原菌感染宿主的一个靶蛋白;而在高等动物,血清CK可以免受病原菌的作用而不丧失其酶活性,其分子机制包括两个方面:一是CK分子自身的核酸序列突变进化;二是高等动物体液中存在保护CK不被病原菌作用的因子。高等动物CK不被病原菌作用的分子机制的揭示,对阐明宿主与病原菌相互作用规律具有十分重要的意义。
本论文的研究结果主要包括以下几个方面:
(1)以7种不同进化层次的代表动物为研究对象,分析其体液中的CK酶活力含量,发现高等动物和低等动物体液内CK含量存在巨大差异,即随着进化层次的升高,CK含量下降显著。同时,还探讨了细菌与这7种代表动物体液CK的结合情况及结合后对CK酶活力产生的抑制作用。结果发现,细菌可以结合低等动物体液CK并抑制其酶活力,但却无法结合高等动物血清CK,从低等动物到高等动物,细菌对体液CK酶活力的抑制率呈一个从高到低至无的变化趋势。细菌对包括无脊椎动物文昌鱼,脊椎动物鲤鱼在内的低等动物体液CK酶活力的影响是一种剂量依赖关系,而对高等动物人血液中的CK酶活力没有影响。这些研究提示,细菌与CK相互作用与动物进化关系密切。对CK进行系统进化分析,发现低等无脊椎动物CK在进化上更接近脊椎动物线粒体型CK而非细胞质型CK。
(2)发现高等哺乳动物(小鼠、人)的血清可以完全阻断脊椎动物CK与细菌的结合,但无法完全阻断低等无脊椎动物文昌鱼CK与细菌的结合。确定了其阻断机制为高等动物血清中存在保护CK不被细菌作用的因子,并发现这些因子存在于血液与细菌相互作用的蛋白中。进一步研究发现,动物纯化CK与细菌的结合作用都是瞬时的:当纯化CK先与细菌作用后,人血清就无法阻断其与细菌的结合,但只要血液与CK混合,血液中的因子就会保护CK不被细菌结合。通过MBP-taggedCK与人血液的pulldown试验和免疫共沉淀试验,靶定了高等动物人血清中保护CK不被细菌作用的因子是血纤维蛋白溶酶原(plasminogen,PLG)和免疫球蛋白(Ig),其中PLG为最关键的保护蛋白。有关PLG保护CK不被细菌作用的分子机制的研究发现,高等动物体液中PLG和CK的相互作用既避免了微生物对体内重要能量系统的攻击,又可以减弱细菌以PLG为靶标感染机体的作用。
(3)结合生物信息学分析,通过对高等动物人M型CK和低等动物文昌鱼CK的多次片段突变和定点突变,结合血清阻断实验和蛋白相互作用试验,确定人M型CK的第330个氨基酸:缬氨酸与高等动物体液CK保护因子的作用密切相关,确定了CK分子在进化过程中发生突变有利于血浆保护因子的结合。高等动物体液CK避免被病原微生物作用进而保障其酶活力不受影响,是动物体和CK本身共进化保护的结果。
(4)通过far-Western blotting和免疫共沉淀实验,证明了高等动物M型CK可以和大肠杆菌的三个外膜蛋OmpA,OmpX和OmpW直接结合,B型CK仅可以和大肠杆菌外膜蛋白OmpW结合,且高等动物M型CK可以和副溶血弧菌外膜蛋白OmpA和OmpW结合。