在哺乳动物,基于重链恒定区抗原性的不同,免疫球蛋白被分为5个主要类型,Ig M,Ig G,,Ig A,Ig D,和Ig E。在禽类只有3个类型的抗体(Ig M,Ig Y,Ig A)被发现。雉鸡传染性疾病诊断和研究的困难是缺乏商品化可用的物种特异性抗雉鸡Ig Y的抗体。Ig Y是一种存在于禽类,两栖类和爬行类血清中的主要抗体,它可能是哺乳动物Ig G和Ig E的进化祖先。Ig Y由2条重链和2条轻链组成。重链含有4个恒定区,它的长度相似于哺乳动物的Ig E。与哺乳动物Ig G相比,禽类Ig Y在重链(命名为upsilon链,υ)恒定区含有一个额外的区域并缺少铰链区。已知许多内源性肽对人类和其他脊椎动物物种的免疫、内分泌、神经和其他系统的某些功能展示出特定的调节作用。这样的调节肽序列已在人Ig G被发现,包括促吞噬肽,rigin,肽p24,immunorphin和immunocortin,并且它们被认为充当刺激或抑制免疫应答的信号因子。但是,有关禽类Ig Y抗体来源的免疫肽的功能信息是稀缺的。本试验重点研究了雉鸡Ig Y重链恒定区片段的遗传变异和其生物学功能。研究内容主要分为四部分:第一部分雉鸡Ig Y重链恒定区基因的克隆表达及序列分析根据鸡和鸭Ig Y序列设计引物(Gen Bank登录号分别是X07174和AJ517505),从20周龄的雄性雉鸡脾脏内提取总RNA,并使用Prim Script RT试剂盒反转录成c DNA。获得750 bp,478 bp和318 bp三个c DNA片段。750-bp的c DNA片段含有JH,CH1,CH2和部分CH3区;478 bp的c DNA片段含有CH2和CH3区;318 bp的片段含有CH1区。将三个片段分别编码的250,159,和106个氨基酸的蛋白质。随后进行了原核重组表达,表达的重组蛋白r Ph Cυ-750和r Ph Cυ-478具有抗原性。雉鸡Ig Y抗体重链恒定区氨基酸序列显示出与鸡(71.2%)的同源性最高。对Ig Y的系统发育分析表明,雉鸡与鸡和鸭比任何其他分析的脊椎动物物种更密切相关。第二部分免疫交叉反应性测定不同种属动物的Ig G或Ig Y的氨基酸同源性不同,预示了不同动物Ig G与不同动物的酶标二抗间可能存在交叉反应。通过dot-ELISA,检测了鸡,雉鸡,人类,小鼠,狗,猪,狐狸,水貂,貉和兔血清抗体分别与用HRP标记的羊抗鸡Ig G,兔抗犬Ig G,,兔抗小鼠Ig G,或羊抗兔Ig G间的交叉反应性,同时通过Western-Blot试验分析了雉鸡Ig Y-CH重组蛋白与兔抗鸡二抗间的免疫原交叉性。结果表明,不同动物的Ig G或Ig Y之间,或多或少都存在一些免疫交叉性,不同纲目之间的动物也可有一定程度的交叉免疫反应,雉鸡Ig Y-CH重组蛋白与兔抗鸡二抗间有免疫原交叉性。第三部分雉鸡Ig Y-CH肽生物功能活性测定使用ABCpred服务器分析雉鸡Ig Y-CH的氨基酸序列,得到5个CH-肽,T10L(TARPTSSPQL),V10D(VSWEGVGGSD),R12V(RVPPTSPSAPEV),A10Y(AIPPSPGELY),和N12S(NVSKEDWKEGKS),人工合成后用于检测雉鸡Ig Y-CH肽对鸡外周血单核细胞的体外免疫调节活性。CH肽在不同浓度下与小鼠外周血单核细胞共培养18h检测上清液中细胞因子含量。我们的研究结果表明,四肽(T10L,V10D,R12V,和A10Y)能够诱导白细胞介素(IL)-1β,IL-4和干扰素γ的显著上调,CH肽具有在禽类物种发挥免疫调节剂的潜在作用。第四部分雉鸡Ig Y-Fc肽的亚细胞定位及其与细胞结合的研究通过激光共聚焦显微镜对FITC标记的雉鸡Ig Y-Fc肽在鸡的外周血单核细胞内进行亚细胞定位,并通过流式细胞仪对雉鸡Fc肽结合到鸡外周血单核细胞进行定量检测。FITC标记的雉鸡Fc肽作用鸡的外周血单个核细胞1h时,Fc肽主要富集在细胞膜上,细胞核和细胞质中基本无可激发荧光。A10L(AKLKCLVVNL)、R10Q(RFIQRTLQKQ)和A10Y(AIPPSPGELY)与细胞的结合率分别为96.8%、97.5%和96.3%,R10Q与细胞的结合率最高。FITC标记的雉鸡Fc肽作用鸡的外周血单个核细胞18h时,Fc肽主要富集在细胞核区域内,细胞膜和细胞质中基本无可激发荧光。