创伤性脑损伤(Traumatic brain injury, TBI)是人类致伤致残的主要原因之一，其可分为原发性脑损伤和继发性脑损伤，其中继发性脑损伤是导致患者死亡的重要原因。TBI早期谷氨酸大量释放，作用于各类谷氨酸受体而发挥兴奋性神经毒作用，引起Ca2+通道持续开放致神经元凋亡，是加重继发性损伤的重要原因。谷氨酸与配体门控型Ca2+通道NMDA受体结合后激活该受体，允许Ca2+大量通过，并且由于NMDAR失活缓慢,致使细胞内Ca2+浓度升高上千倍，加重继发性损害，因此研究如何降低NMDA受体引起的神经元损伤，具有显著的临床意义。Homer1a分子属于Homer蛋白家族，是一个作用广泛的即早基因(ImmediateEarly Gene)，和多种疾病的发生发展都有紧密联系，能够调控多种细胞分子功能。作为突触后致密物质（PSD）的一员，Homer1a可以调控突触后致密物之间的信号转导，是一个重要的钙调节蛋白，它也可以通过物理替代相应结构起到负向调节作用，并且Homer1a能与Shank、NMDA、nNOS等分子发生相互作用。目前Homer1a与NMDAR所致损伤的关系以及和NMDAR下游分子通路的关系尚不清楚，由于NMDA受体在继发性脑损伤中的重要作用，研究Homer1a在NMDA受体所致神经元损伤中的作用具有深远意义。实验一NMDA动物模型的建立目的建立一种可靠而且稳定的小鼠NMDA脑损伤模型，为进一步研究损伤后脑组织病理生理变化及NMDA损伤机制奠定基础。方法将小鼠随机分为假手术组和NMDA皮层注射损伤组，检测NMDA脑损伤后NSS评分和血清NSE，观察甲苯胺蓝染色变化，阐明小鼠皮层注射NMDA致脑损伤模型的效果。结果小鼠皮层注射NMDA损伤后24h，光镜下观察不同组甲苯胺蓝染色变化发现：假损伤组皮层完整，尼氏体清晰可见，皮层无损伤，损伤组损伤灶周围神经元数量明显减少，染色变浅，皮层完整性受到破坏。皮层注射NMDA后观察小鼠行为发现：NMDA损伤组较假损伤组NSS评分高，说明损伤严重。在损伤后12h，24h， NMDA损伤组小鼠血清中NSE高于假损伤组。结论通过检测脑损伤后NSS评分、血清NSE和甲苯胺蓝染色的变化证实，皮层注射NMDA致脑损伤模型具有明显的损伤作用，是一种简单而有效的在体NMDA脑损伤模型。实验二体外培养小鼠脑皮层神经元NMDA损伤模型的建立目的建立一种可靠、稳定而且有效的离体培养小鼠脑皮层神经元NMDA损伤模型。方法对培养成活一周的原代小鼠脑皮层神经元进行神经元纯度鉴定。神经元培养成活后11-15d，按照Koh等的方法，进行离体培养神经元NMDA损伤。将神经元随机分为假损伤对照组和NMDA损伤组，通过Hoechst染色,检测细胞内ROS的水平以及细胞LDH释放，明确神经元NMDA损伤的效果。结果对培养的神经元进行NF200染色显示：培养的神经元纯化率较高。神经元在NMDA损伤后0h，各组间的LDH浓度无明显变化；伤后6h~24h，与就假损伤对照组相比，损伤组的LDH浓度高。进行NMDA损伤后24h，与对照组相比，细胞的凋亡显著增加，ROS荧光亮度显著升高。结论我们通过检测培养液乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase，LDH）水平、ROS染色、以及Hoechst染色的变化证明，NMDA对神经元有确切的致伤作用。该模型是一种简单而且有效的离体皮层神经元NMDA损伤模型，为研究NMDA所致神经元死亡相关分子机制等提供了一个可靠、有效平台。实验三NMDA损伤（在体与离体）后Homer1a蛋白表达目的通过在体及离体实验，了解NMDA脑损伤后Homer1a表达变化。方法将小鼠或细胞分为假损伤对照组和NMDA损伤组，在NMDA脑损伤模型（在体与离体）基础上，采用免疫组织化学法、免疫印迹法（Western Blotting）和PCR法检测NMDA脑损伤后Homer1a蛋白以及mRNA的变化。结果在体模型中使用NMDA注射皮层后24h，使用免疫组化染色法观察周边脑组织中Homer1a蛋白表达，发现NMDA注射组表达Homer1a蛋白的阳性神经元数高于对照组。在离体NMDA脑损伤模型中，用免疫印迹法检测Homer1a蛋白在NMDA损伤后的表达变化，发现NMDA细胞损伤后6h至24h，Homer1a蛋白表达量明显增加。用普通PCR方法检测Homer1a mRNA，发现相比对照组，NMDA损伤组Homer1a mRNA于损伤后1h、3h表达明显增加。结论Homer1a蛋白和mRNA水平在NMDA损伤后增加，这提示Homer1a可能在NMDA脑损伤中发挥着重要的作用，这种表达水平的增加可能与神经元自身保护机制有关。实验四NMDA损伤对Homer1a K/O小鼠的作用目的通过在体实验，明确NMDA损伤对Homer1a K/O小鼠的作用。方法首先对Homer1a基因敲除鼠进行筛选与鉴定，后将小鼠分为2个组，KO（Knock Out）小鼠组和WT（Wild Type）小鼠组，建立小鼠NMDA脑损伤模型，用甲苯胺蓝染色计算梗死面积、对小鼠进行神经功能学评分（NSS），以及检测血清NSE，明确Homer1aK/O小鼠和WT小鼠的对NMDA损伤作用效应的区别。结果我们成功杂交出了Homer1a基因敲除鼠，普通PCR结果显示，基因敲除小鼠有效，无Homer1a基因表达，并且有Homer1c基因表达。小鼠皮层注射NMDA后24h，尼氏染色计算梗死面积后发现Homer1a K/O组较WT组脑皮层损伤重；NSS评分提示在12h、24h，Homer1aK/O组较WT组评分高；血清NSE含量检测提示损伤后24h，Homer1a K/O组血清中NSE较WT组高。结论这些结果提示，Homer1a基因敲除加重了NMDA引起的脑损伤，Homer1a基因对NMDA脑损伤具有保护作用。实验五体外模型中过表达Homer1a对NMDA神经元损伤的影响目的前面的实验结果提示，敲除小鼠Homer1a基因加重NMDA脑损伤，推论Homer1a基因对NMDA脑损伤有保护作用，但仍需进一步细胞模型中得到证实。方法进行脑皮层神经元原代培养后，转染LV-Homer1a，鉴定表达后，将细胞分为对照损伤组，空载体组，Homer1a过表达组，建立NMDA损伤模型，观察细胞细胞死亡率，进行Hoechst染色分析以及损伤后LDH值测定，Western-Blot进行损伤后p-Caspase-3分析。结果通过使用过表达Homer1a的慢病毒载体（LV-Homer1a）转染神经元发现过表达Homer1a成功，能够明显检测出外源性的Homer1a。用慢病毒载体（LV-Homer1a）转染神经元，造模后24h，对各组神经元进行Hoechst染色，发现转染LV-Homer1a降低了凋亡细胞比例和，降低了p-Caspase3表达。LDH结果提示伤后6h、12h、24h，与对照损伤组、LV-Vector损伤组比，LV-Homer1a的LDH浓度较低。结论这些结果提示，离体试验中，Homer1a能够降低凋亡细胞的比例，保护神经元，也验证了在体试验的结果。实验六Homer1a对NMDAR致损伤功能的影响以及nNOS的活性影响目的前面的实验结果证实，Homer1a对NMDA所致损伤后的神经元具有直接保护作用，但具体的机制尚不清楚。本实验拟在离体模型中研究损伤后Homer1a对NMDAR下游通路的影响，以及Homer1a对nNOS活性的影响。方法脑皮层神经元原代培养成活后转染LV-Homer1a，建立NMDA损伤模型，随机将细胞分为NMDA损伤组、空载体组、转染LV-Homer1a组，观察细胞内产生的ROS，Ca2+、并进行全细胞膜片钳记录，用Western Blot检测各组中细胞内p-nNOS、 p-ERK、 p-CREB的表达。结果神经元NMDA损伤后24h，与对照组相比，转染LV-Homer1a降低了ROS生成和NMDA引起的钙离子内流。转染LV-Homer1a降低了神经元NMDA受体的电流峰值。Western Blot结果提示：转染LV-Homer1a后降低NMDAR过度激活导致的ERK，CREB，nNOS的激活。结论这些结果提示，离体神经元转染LV-Homer1a后，改变了NMDAR的属性，降低了其通透性，减弱其下游通路的过度激活，这为进一步阐明了Homer1a蛋白对NMDA脑损伤的保护机制奠定了基础。实验七Homer1a对神经元中NMDAR以及NMDAR复合体的影响目的前面的实验结果证实，Homer1a对NMDA所致神经元损伤具有直接保护作用，且改变了NMDA属性以及其下游通路的活性，但是具体的机制尚不清楚。我们推测，Homer1a可能是通过调控NMDAR本身分布以及NMDAR和相关的分子集团结合发挥保护作用。方法通过向HEK293T细胞转染NR1NR2B受体以及Homer1a，进行膜片钳记录，按照转染的分子不同分为空载体组、NR1/NR2B组、NR1/NR2B/Con组、NR1/NR2B/Homer1a组，研究Homer1a对NMDA受体功能的直接影响。在神经元转染LV-Homer1a后，将细胞分为空载体组、过表达Homer1a组，通过提取提纯膜蛋白，检测Homer1a对NMDA受体亚基NR2B分布的影响，通过免疫共沉淀，检测转染LV-Homer1a对NMDA受体亚基NR2B与nNOS蛋白结合的影响。结果在293T细胞上我们成功过表达了NR1NR2B，且具有受体活性，同时转染LV-Homer1a发现，Homer1a对293T细胞上的NR1/NR2B受体的峰值无明显影响。体外培养神经元转染LV-Homer1a72h，发现转染LV-Homer1a后降低膜上NR2B分布。通过对NR2B以及nNOS进行免疫沉淀发现，转染LV-Homer1a降低了NR2B和nNOS之间结合。结论这些结果提示，Homer1a能够促进NMDAR亚基NR2B的内陷以及破坏NR2B,nNOS之间的结合，这两点可能是Homer1a降低NMDA神经元损伤的重要机理。