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背景:铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）又称绿脓杆菌,假单胞菌科,是具有单向运动性的革兰氏阴性细菌,在自然界中广泛地存在。绿脓杆菌在临床上是十分常见的条件致病菌,可引发机体多种组织和部位的感染,以烧伤创伤、中耳、角膜、尿道和呼吸道最为常见,尤其是引起囊性纤维化病人的肺部感染,是主要的院内感染病原菌之一。铜绿假单胞菌的致病性与它产生的毒力因子和大量毒素密切相关,铜绿假单胞菌可以通过4种分泌系统向环境中分泌致病因子,分泌的毒力因子包括弹性蛋白酶（LasB和LasA）、磷脂酶D、生物膜、外毒素A、外膜蛋白opr家族和碱性蛋白酶（AprA）等。所以针对铜绿假单胞菌的感染、防御以及治疗越来越受到人们高度的重视。铜绿假单胞菌分泌的碱性蛋白酶（AprA）蛋白是锌指家族蛋白酶（zinc metalloprotease）,全长为479个氨基酸,相对分子量为50,433Da。已有的研究结果表明AprA可以裂解宿主来源的补体分子如C2和C1q以及细胞因子IFN-?和TNF-α等,但目前关于AprA如何参与铜绿假单胞菌致病过程的研究报道较少。铜绿假单胞菌同时可以表达AprA抑制因子AprI,其全长为131个氨基酸,相对分子量为14,410Da。Apr I可以有效的抑制AprA对底物的降解作用。鞭毛蛋白Flagllin,是由flic基因编码,并且其有A和B两种亚型,在铜绿假单胞菌中以B亚型为主,B亚型的Flagellin全长为488个氨基酸,相对分子量为49,242Da。NETs是由中性粒细胞释放到胞外的网状结构,主要成分有DNA、组蛋白（Histone）,弹性蛋白酶（NE）、髓过氧化物酶（MPOS）和组织蛋白酶G等。NETs可清除多种微生物,包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌,寄生虫和真菌等,比如金黄色葡萄球菌,铜绿假单胞菌,志贺氏菌和白色黏球菌等。目前多种动物（比如斑马鱼,家禽,小鼠和人）的中性粒细胞都可以形成NETs。噬菌体抗体库技术是指将噬菌体的外壳蛋白PIII或PVIII基因与抗体的VH和VL的基因重组,通过感染大肠杆菌,在大肠杆菌中繁殖,然后抗体片段Fab或ScFv与外壳蛋白以融合蛋白的形式展示在噬菌体表面上。这种噬菌体颗粒既能感染宿主菌进行扩增又可以特异识别抗原,经过“吸附一洗脱一扩增”,就能富集并筛选出特异性抗体。噬菌体抗体库通过将基因型和表型直接联系在一起,可高效率地从许多克隆中筛选出高特异性地抗体。补体是由蛋白质网络组成的固有免疫级联反应防御系统,可以分为经典途径、旁路途径或凝集素途径,能够有效的清除入侵宿主体内的病原体并发挥多样性生物学效应。研究目的:通过重组表达铜绿假单胞菌AprA蛋白以及相应的抑制分子和底物蛋白,对其生物学功能进行了初步的研究,并探讨了其参与铜绿假单胞菌致病过程中的可能机制。研究方法:（1）:铜绿假单胞菌AprA蛋白及其抑制剂AprI蛋白和底物蛋白Flagellin的表达及功能的初步探究AprA、AprI和Flagellin蛋白的表达:通过构建AprA,AprI和Flagellin蛋白的重组表达载体,利用大肠杆菌表达系统重组表达AprA、Apr和Flagellin蛋白,利用变性复性得到AprA蛋白,以及通过Ni2+螯合树脂亲和纯化得到AprI蛋白和Flagellin蛋白。（2）:AprA特异性抗体的制备和功能初步研究补体介导的红细胞裂解实验(CH50)结果表明AprA能显著抑制补体经典通路的活化,且具有剂量依赖关系。为了深入研究AprA的生物学功能,我们利用重组AprA蛋白免疫大耳白兔制备了其多克隆抗体（anti-AprA）。同时,利用噬菌体抗体库技术,经过三轮筛选获得一个全人源单克隆抗体YG4,利用哺乳动物细胞表达体系重组表达了YG4。ELISA结果表明anti-AprA和YG4都能够特异结合AprA。其中,YG4与Apr A蛋白结合的EC50值为74.5ng/ml。（3）:AprA通过降解氨酸化组蛋白H3（Cit-H3）抑制NETs的形成我们利用PMA刺激人中性粒细胞,体外诱导NETs形成。加入AprA蛋白后,发现其能够破坏NETs,进一步的研究结果表明AprA能够特异裂解NETs关键组分Cit-H3。结论:⑴.AprA能够裂解Flagellin且具有时间依赖性,而AprI可以显著抑制AprA裂解Flagellin的活性。⑵.anti-AprA以及YG4都能够增强AprA对补体通路活化的抑制作用,从而提示AprA刺激机体产生的抗体具有抗体依赖的增强作用。⑶.AprA可能通过裂解Cit-H3蛋白抑制NETs的形成,从而抑制其对细菌的杀伤,介导铜绿假单胞菌的免疫逃逸。