论文部分内容阅读
柑橘是世界第一大果树,在我国果树产业中具有重要的地位。但是,周期性的冻害严重影响了柑橘的产量和品质,培育抗寒品种是解决该问题的有效途径之一。然而,柑橘属植物具有多胚性、遗传高度杂合、童期长、雌雄性败育等特点。柑橘基因工程以及在此基础上的柑橘遗传转化为缩短育种周期、获得抗寒、优质柑橘种质资源提供了新的途径。
CBF(CRT/DRE(C-repeat/dehydration responsive element)binding factor)是一种调控一系列植物冷驯化相关基因表达的转录因子,在低温诱导下迅速合成,与下游基因启动子上的CRT/DRE元件结合,促进基因的转录,进而合成糖类、脯氨酸和膜蛋白等物质,提高植物的抗寒性。基因转化实验证明,CBF基因在拟南芥和油菜等植物中超表达,使转基因植株的低温耐性显著增强。这一发现为利用基因工程手段提高植物耐寒性提供了新途径。
本研究的目的是:利用分子生物学手段分别构建枳(Poncirus trifoliata(L.)Raf.)Ptcbfa、Ptcbf1两个基因的超量和抑制表达载体,并转化柑橘属植物和烟草(Nicotianatabacum L.),以期揭示柑橘中的CBF低温应答途径,为培育优良的柑橘抗寒新品种奠定基础。本研究获得的主要结果如下:
1.Ptcbfa基因表达载体的构建。超量表达载体的构建(4PMVCBFa):将克隆得到的Ptcbfa基因,前面连接CaMV35s启动子,后面连接Nos终止子,得到超量表达载体；RNAi干涉载体的构建(4DHRCBFa):在GcnBank中,将Ptcbfa基因与其它植物基因序列比对分析,选择与其它物种中无同源性的一段片段,与空干涉载体DHRVP同源重组,使得这一片段分别以正向和反向连接于载体上,且中间由载体上原来存在的一段Intron内含子片段隔开,前面连接CaMV35s启动子,后面连接Nos终止子,得到干涉载体。
2.用根癌农杆菌介导的方法,将构建好的4PMVCBFa载体对柠檬(Citrus limon(L.)Burm cv.Eureka)进行了转化。转化后的柠檬再生植株,分别做了PCR和Southern鉴定,经鉴定,转基因植株具有较高的再生率和阳性率。
3.对转化Ptcbfa基因超量表达载体的柠檬植株,测定了部分反应抗寒性强弱的指标。以未转化柠檬植株为对照,测定了转化和对照柠檬植株中,经不同低温处理后的蔗糖、葡萄糖、果糖、肌醇、苹果酸、柠檬酸等的含量,并测定了两者的电导率,然后做了半定量RT-PCR分析。所得结果表明,转Ptcbfa基因的柠檬植株抗寒性有所提高,有望进行下一步的研究。
4.将构建好的Ptcbfa基因的两个载体,用根癌农杆菌介导的方法,对椪柑(Citrusreticulata Blanco)、烟草进行了遗传转化,并且获得了部分转化植株,有待进一步的研究。
5.克隆了几个不同柑橘品种,橙(Citrus sinensis Osbeck)、柚(Citrus grandisOsbeck)、柠檬中的cbf1基因,核苷酸和氨基酸序列比对表明,枳、橙、柚、柠檬几个品种中的cbf1基因存在明显的差异。经RT-PCR实验分析,发现柠檬与另几个品种cbf1的表达有很大差异。
6.研究了Ptcbf1基因在枳中的表达特性,发现Ptcbf1基因具有冷诱导表达的特性,但存在一定的组成型表达,低温诱导时,表达先逐渐增强后又逐渐降低。
7.研究了包括cbf1基因在内的几个冷相关基因,在两个抗寒性不同的柑橘品种(枳和桠柑)中的低温表达特性,发现这几个基因在枳中对低温反应较在桠柑中要敏感。在枳中,随着低温处理时间的延长,几个冷相关基因的表达量有明显的升降趋势,而在桠柑中,表达量变化幅度不是很大。
8.构建了Ptcbf1基因的超量表达载体和RNAi抑制表达载体,分别命名为:5PMVCBF1、5DHRCBF1。
9.利用根癌农杆菌介导的方法,对柠檬和烟草进行了5PMVCBF1载体的转化；对椪柑同时进行了5PMVCBF1和5DHRCBF1两个载体的转化,已经获得部分转化植株。