乳液PCR是单分子PCR技术,通过油相的阻隔,把水相间隔成数目庞大的小水滴,这些小水滴构成了独立的PCR反应空间,最理想的状态下每个小水滴中只含有1个DNA模板,此时小水滴中的PCR反应不会受到竞争干扰。乳液PCR的优点是:(1)抗干扰能力强;(2)能消除竞争抑制;(3)高通量和高效率;(4)灵敏度高;(5)绝对定量。本课题利用乳液PCR的特点,建立了高效构建次级ssDNA文库的乳液不对称PCR和乳液单引物PCR方法。同时还建立了用于临床检验诊断的高灵敏度的两步乳液PCR法,并用初步应用到结直肠癌患者血清游离P16基因甲基化水平和乙型肝炎患者血清中乙型肝炎病毒核酸的检测中。第一部分建立和优化乳液不对称PCR高效构建随机ssDNA文库目的:建立并优化乳液不对称PCR来构建ssDNA次级文库。方法:乳液不对称PCR通过乳液颗粒把不同种类的模板隔开形成单分子PCR,每个模板分开扩增互不影响,不会形成非特异性杂交。以ssDNA文库为模板的乳液不对称 PCR 100μl 体系含 50 mmol/L KC1、10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.6),2.5mmol/LMgC12、0.5mmol/LdNTP、0.4 μmol/L 上游引物、0.02μmol/L下游引物、0.04μg/mL模板和0.1U/μLpfuDNA聚合酶。优化实验时,模板浓度优化范围从0.0004 μg/mL到40 μg/mL ,上游引物浓度从0.2 μmol/L到1μmol/L,下游引物浓度从0.0025 μmol/L到0.02μmol/L。扩增反应条件为94℃变性30 s,然后进入35个循环94 ℃变性40 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s,最后延伸3 min。优化循环数从10到50个循环。扩增结束破乳液回收产物,并进行聚丙烯酰氨凝胶电泳和银染,对产物进行分析。对破乳液回收产物同时进行纯化回收,并用磁珠分离出ssDNA文库,检测浓度。同时对乳液不对称PCR与常规不对称PCR进行对比研究。结果:常规不对称PCR扩增ssDNA文库,在25个循环即有明显副产物出现,30个循环时出现明显的涂抹带,25个循环后dsDNA产物量随着循环数的增加逐渐减弱,只至消失,后期不对称PCR扩增无模板可用,只有非特异性扩增,只产生非特异性产物。因为25个循环即有明显副产物出现,用磁珠分离的ssDNA文库不纯,因此只分离检测10、15和20个循环时的浓度,分别为0.76,1.43和2.02 μg/mL。乳液不对称PCR在从10到50个循环中均无副产物,只有ssDNA条带和dsDNA条带,且dsDNA条带无明显减少,磁珠分离10、15、20、25、30、35、40、45和50循环数的产物浓度分别为0.58、1.22、1.78、2.25、3.21、4.32、6.43、6.71和6.55μg/mL产物量明显多于常规不对称PCR。在优化乳液不对称PCR时,首先优化模板浓度。当模板浓度从0.0004μg/mL到0.04 μg/mL时产物量随模板浓度增高而增多,再增加模板浓度产物量无明显变化,当模板浓度为4 μg/mL时,副产物与产物呈涂抹带,无法分离。模板浓度为0.04～0.4μg/mL时,无肉眼可见副产物,ssDNA产物量也足够多,在模板浓度为0.4 μg/mL时,dsDNA浓度明显下降。因此模板浓度在0.04μg/mL到0.4 μg/mL范围内均可。在优化引物浓度时,不仅优化了上下游引物浓度比,还优化了上下游引物的量。不对称PCR的产物是ssDNA,因此当引物浓度过高时,易与已形成的ssDNA杂交进行非特异性扩增,所以我们首先优化浓度较高的上游引,上游引物浓度从0.2～1μmol/L时,产物量无明显变化,当上游引物浓度为0.6μmol/L时有少量副产物,为1μmol/L时有大量副产物生成。因此上游引物浓度在0.2～0.4μmol/L范围内均可。以0.4 μmol/L为上游引物浓度,优化下游引物浓度时,下游引物浓度从0.0025～0.02 μmol/L时产物量逐渐上升且无副产物,因此选择下游引物0.02 μmol/L为最佳浓度。结论:乳液不对称PCR,不需要优化循环数,不会出现常规不对称PCR由过度扩增引起的副产物问题,只需通过简单模板浓度和引物浓度优化,就能得到高质量的ssDNA文库。该法能简单、方便、高效的构建ssDNA文库,用于适配子的筛选对筛选效率提高有一定的帮助。第二部分乳液单引物PCR构建次级ssDNA文库方法的建立及优化目的:建立并优化乳液单引物PCR扩增法构建随机ssDNA文库。方法:构建90 bp的随机寡核苷酸文库,运用乳液PCR扩增出双链DNA文库,再以双链DNA文库为模板,分别用乳液单引物PCR和常规单引物PCR扩增构建ssDNA文库,并进行比较。乳液单引物PCR100μl体系含50mmol/L KCl、10mmol/LTris-HCl(pH8.6),2.5mmol/LMgCl2、0.5mmol/LdNTP、0.75μmol/L上游引物、9 pmol/L模板和0.1 U/μL pfu DNA聚合酶。优化实验时,模板浓度从1 pmol/mL到18 pmol/mL,上游引物浓度从0.5到3 μmol/L,DNA聚合酶浓度从 0.075 U/μL 到 0.175 U/μL,dNTP 浓度从 0.25 到 1.25 mmol/L。反应条件为94 ℃变性30 s,然后进入35个循环94 ℃变性40 s、60 ℃退火30 s、72℃延伸30s,最后延伸3 min。优化退火温度时,温度从50℃到70℃。优化循环数从10到35个循环。结果:乳液PCR可以高质量的把ssDNA转化成dsDNA。常规单引物PCR扩增构建随机ssDNA文库,发现15个循环时就有明显副产物出现,在20个循环时目的产物和副产物已经融合成涂抹带,无法分离;乳液单引物PCR在10～35个循环均无副产物,且产物量明显高于单引物PCR。作为模板的dsDNA在常规单引物PCR扩增过程中随循环数的增加逐渐减少,到25个循环即消失,而乳液单引物PCR的模板量在10～35个扩增循环中无明显减少。在优化乳液单引物PCR时,首先优化模板浓度,当它从18pmol/mL到1pmol/mL时,产物量迅速下降,到1pmol/mL时产物几乎降到0,模板浓度对产物量影响最大。引物浓度对副产物的影响最大,退火温度同时影响产物与副产物的量。酶浓度大于0.1 U/μL出现副产物,dNTP浓度对扩增影响相对较小。结论:乳液单引物PCR构建随机ssDNA文库同样不需要优化循环数,无过度扩增产生的副产物。因为乳液单引物PCR模板为ssDNA通过PCR扩增得到dsDNA,模板量足够,而乳液不对称PCR所用的模板为筛选过程中直接洗脱的ssDNA,所以乳液单引物PCR在模板量的选择上更有优势,因此该法也可高效的构建ssDNA文库。第三部分两步乳液PCR的建立及在结直肠癌患者p16基因甲基化检测中的初步应用目的:建立检测P16基因甲基化的两步乳液PCR方法,并初步应用在结直肠癌患者血清中P16基因甲基化检测。方法:分别构建含甲基化和非甲基化P16基因序列的质粒,转入大肠杆菌DH5α感受态细菌;建立两步乳液PCR方法:(1)油包水乳液PCR:用0.1 ml的反应体系(10 mmol/L KCl、20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.8)、0.2 mmol/L MgSO4、16mmol/L(NH4)2SO4、0.1%TritonX-100、0.5mmol/LdNTP、0.2μmol/L引物、4ul菌液模板和0.1 U/μL pfu DNA聚合酶),制备乳液后分装100 μl/管,立即进行PCR扩增。反应条件为94 ℃变性5 min,然后进入15个循环94℃变性30 s、甲基化为69℃ (非甲基化为65℃)退火60s、72℃延伸60s,最后延伸3 min。(2)水包油乳液PCR:油包水乳液PCR扩增结束后,14,000 rpm离心10min,去上层油相,加入33μlPCR反应体系(10mmol/LKCl、20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.8)、0.2 mmol/L MgSO4、16mmol/L(NH4)2SO4、0.1%TritonX-100、0.5 mmol/L dNTP、0.4 μmol/L 引物和 0.1 U/μL pfu DNA 聚合酶),充分震荡混匀,制成水包油乳液颗粒,放入PCR仪按上述扩增条件扩增35个循环。分别应用甲基化特异性PCR和两步乳液PCR检测含不同浓度的甲基化和非甲基化P16基因序列的菌液,比较两种方法的特点。分别检测36例结直肠癌患者和25健康体检者血清中p16基因的甲基化情况。结果:灵敏度实验和干扰实验结果显示,两步法乳液PCR比MSP具有更高的灵敏度和更强的抗干扰能力。两步法乳液PCR的检测灵敏度是MSP的10倍。在非甲基化基因的干扰下,两步法乳液PCR能在甲基化与非甲基化比例为1:100的情况下检测出甲基化,而MSP只能在甲基化与非甲基化比例为1:10的情况下检测出甲基化。在检测结直肠癌患者血清中p16基因的甲基化时,两步法乳液PCR的检出率为55.5%,而MSP检出率只有44.4%。结论:两步乳液PCR在检测P16基因甲基化时,表现出较高的灵敏度和抗干扰能力,在临床检测实验中比MSP检出率更高,可应用于临床肿瘤的早期诊断。第四部分两步乳液PCR检测乙型肝炎病毒核酸方法的建立及初步应用目的:建立两步乳液PCR检测乙型肝炎病毒核酸方法,并初步应用于临床。方法:选取乙型肝炎病毒核酸定量检测结果<500 IU/mL的标本78例,应用荧光定量PCR法检测并选取无扩增曲线的标本。再分别用普通PCR和用两步乳液PCR检测乙肝病毒核酸,并用ELISA检测乙肝病毒血清标志物。结果:无扩增曲线的40例中,通过两步乳液PCR有14例(35 %)为阳性,而常规PCR都为阴性。40例标本中有27例为乙型肝炎病毒表面抗原阳性同时e抗原阴性,即临床诊断为非活动性乙型肝炎病毒表面抗原阳性携带者,而这27例中有10例可通过两步乳液PCR检测出乙型肝炎病毒核酸。结论:两步乳液PCR体系较荧光定量PCR有较高的检测灵敏度,能进一步检测定量结果<500 IU/mL的病人血清中是否有乙肝病毒,可作为临床荧光定量PCR的补充检测手段,为临床乙肝的诊疗提供依据。