论文部分内容阅读
乳腺癌是威胁女性健康最常见的恶性肿瘤之一,而乳腺癌转移的发生往往是导致很多患者死亡的最终原因,并且晚期的乳腺癌病人常会因为转移性的疼痛而十分痛苦,生存质量受到严重影响。因此,发现并研究乳腺癌发生及转移相关的基因具有十分重要的应用价值。G蛋白偶联受体(GPCR)是一类重要的药理学靶标,这些受体调控着大量的细胞进程,它们的失调经常导致各种疾病的发生。GPCR粘附家族是一个新的GPCR亚家族,目前已经有研究表明:一些GPCR粘附家族的成员在癌细胞中异常表达,并且参与到众多的癌细胞生理进程中。本研究期望找到与乳腺癌发生发展密切相关的粘附GPCR,为乳腺新的受体类诊断靶分子的发现和研制新的受体类治疗药物提供帮助。首先,本研究通过对GPCR粘附家族成员的在四种不同转移能力乳腺癌细胞系中表达情况的检测,发现了一个在乳腺癌细胞系中表达十分特异的基因——GPR116,而人类的GPR116至今尚无相关研究报道。我们发现GRP116只在高转移的乳腺癌细胞系中表达,在低转移和不转移的乳腺癌细胞系中弱表达或无表达。进一步采用反转录PCR (RT-PCR)、实时荧光定量PCR (Real-time PCR)和蛋白免疫印迹(Western Blot)的方法在六种转移能力梯度下降的乳腺癌细胞系中验证,结果显示GPR116信使RNA (mRNA)和蛋白的表达都和乳腺癌细胞系的恶性程度成很好的正相关。通过比较24例淋巴结转移阳性乳腺癌患者的原发癌和配对的淋巴结转移癌组织,以及75例不同恶化程度的乳腺癌标本和正常乳腺标本中GPR116的表达,进一步确定了GPR116与乳腺癌发生发展密切相关:GPR116只特异的在乳腺癌组织中表达,而在癌旁组织或乳腺正常组织中弱表达或无表达,并且其表达强度与乳腺癌的恶性程度呈正相关。为揭示GPR116在乳腺癌发生发展中所起的具体作用,本研究克隆了GPR116基因全长,构建了含有该全长基因的表达载体,并构建了三个该基因抗体制备用蛋白的表达载体。另一方面本研究确定了能有效降低GPR116的小干扰RNA (siRNA),构建了四个针对GPR116的短发夹RNA (shRNA)慢病毒干扰载体,包装了相应的慢病毒,鉴定出一条有效干扰GPR116的shRNA。利用以上构建的载体,本研究分别在雌激素受体阳性(MCF-7)和阴性(SK-BR-3)的乳腺癌细胞系中过表达GPR116,获得了两株稳定高表达GPR116的乳腺癌细胞株。同时,利用鉴定出的有效的siRNA和shRNA,获得了GPR116瞬时降低和稳定降低的MDA-MB-231乳腺癌细胞株。接着,利用以上构建的稳转细胞株,本研究对GPR116的功能做了进一步的探索,发现:降低了GPR116的MDA-MB-231细胞在体外迁移和侵袭能力明显降低(P<0.01),在小鼠体内转移到肺的能力也明显下降(P<0.001)。同时,过表达GPR116的良性乳腺癌细胞MCF-7、SK-BR-3在体外的迁移和侵袭能力明显提高(P<0.01)。本研究还通过细胞的免疫荧光染色发现GPR116能改变乳腺癌细胞的细胞骨架:GPR116促进细胞骨架肌动蛋白纤维丝的聚集成束,形成张力丝,促进乳腺癌细胞外沿黏着斑的形成。并且GPR116似乎负调控着细胞中β-catenin的表达。为了探究GPR116促进乳腺癌转移表象背后的分子机制,本研究检测了28个已有文献报道的和乳腺癌转移密切相关的基因,发现一个随着GPR116表达的变化而一同变化的基因·——CTGF。已经有研究表明:CTGF能够刺激乳腺癌细胞系的迁移,并且也是必须的。因此,我们考虑GPR116信号通路可能是通过诱导CTGF从而推动了乳腺癌转移。接下来一系列荧光素酶报告基因实验证明了,GPR116能激活CTGF的转录,并且GPR116还能协同TGF-β对CTGF的上调作用。总之,本研究发现了人类GPR116在乳腺中的表达和乳腺的癌变程度正相关。构建了GPR116基因的相关载体,发现其调控乳腺癌细胞骨架、粘附蛋白和β-catenin,表现为促进乳腺癌的转移。本研究还初步探索了GPR116促进乳腺癌转移的分子机制:GPR116可能是通过调控CTGF的转录,和(或)协同TGF-β对CTGF的上调作用,从而表现出促进乳腺癌转移的表象。