在真核生物基因组中存在许多重复序列,其中大多是非编码序列。非编码序列对编码基因的转录、翻译和翻译后等过程具有重要的调控作用,移动元件作为其重要组成部分和生物的进化程度呈正相关。此外,这些移动元件的活化可影响相邻基因的表达,例如在编码区内或临近位置的插入能引起基因突变,从而导致基因表达的变化和基因组的重塑。Long interspersed element1(LINE-1, L1)作为移动元件中唯一一种自主活性的逆转座子,研究发现其在肿瘤细胞普遍激活,在正常分化的细胞中则处于沉默状态,它的非正常激活对细胞的增殖分化和肿瘤的发生发展具有重要的作用,提示其涉及到肿瘤发生发展的分子机制。全长的L1基因有两个开放阅读框ORF1和ORF2,能编码两种蛋白L1-ORFlp和L1-ORF2p;其中L1-ORFlp能与自身核酸结合形成核酸蛋白复合物(ribonucleoprotein, RNP),而L1-ORF2p具有内切核酸酶及外切酶活性,可与L1-ORFlp一起执行逆转座功能。课题组前期研究显示,L1-ORFlp在细胞增殖调控以及肿瘤形成过程中具有重要作用。另外L1的5’UTR包含正义与反义的双向启动子,它们的转录产物能生成双链RNA(dsRNA),继而生成siRNA,报道显示第一个endo-siRNA就来源于L1的转录产物。在dsRNA参与的调控中,RISC(RNA Inducing Silence Complex)的形成是一个重要的步骤,而RISC组分之一的Argonaute被认为是关键的蛋白分子。Argonaute(AGO)蛋白是一种比较保守的碱性蛋白,分子量大小在100kd左右。在人类的AGO蛋白家族中,有四种蛋白,分别是AGO1、AG02、AG03和AG04。AG02是唯一一种具有RNA酶活性的家族成员,它能与siRNA结合形成RISC复合物,实现对靶基因的调控。鉴于L1-5’UTR的转录产物能生成dsRNA,我们认为AGO2可能参与对L1-5’UTR启动子活性的调控。此外,报道显示L1-ORF1p与RISC且有共定位现象,我们推测Ll-ORF1p有可能与AGO2一起参与了L1的负反馈调控。所以我们将AGO2和L1-ORF1p作为目标蛋白研究其调控机制。首先我们研究了Ll-ORF1p蛋白与AGO家族蛋白的相互作用,结果显示L1-ORF1p与AGO1/AGO2/AGO4具有相互作用,而与AGO3没有作用。为探索L1-5’UTR的启动子活性以及dsRNA对其反馈调控的作用,我们利用荧光素酶表达系统,构建了含有全长L1-5’UTR(含有双向启动子,其转录产物能形成dsRNA)以及3’端序列截短的突变体(保留680bp的L1-5’UTR,基本删除反义链启动子序列；保留400bp的L1-5’UTR,完全删除反义链启动子序列)的重组表达载体,通过RNAi干涉下调AGO2的表达,观察L1-5’UTR启动子活性的变化。结果显示,AGO2的下调能增强全长L1-5’UTR的启动子活性,而对分别含有680bp和400bp的L1-5’UTR启动子活性没有明显的影响,鉴于全长L1-5’UTR可生成dsRNA(进一步加工生成siRNA),提示LINE-1的负反馈机制是由双向启动子转录产物所生成的siRNA介导的,AG02在此过程中起着重要的作用。为探索L1-ORF1p是否参与L1的负反馈调控,我们通过过表达实验,观察其对含有L1-5’UTR全长以及3’端截短的不同突变体活性的影响。结果显示,L1-5’UTR无论是全长还是不同截短的突变体,L1-ORF1p对其启动子活性均具有抑制作用。进一步实验显示,AGO2的下调并不能减弱L1-ORF1p对L1-5’UTR启动子活性的抑制作用,提示L1-ORF1p尽管能与AGO2发生相互作用,但L1-ORF1p参与对自身表达的负反馈调控不是通过siRNA介导的,其作用机制需要进一步的探索。鉴于L1在肿瘤细胞中被激活,在正常细胞中则沉默,其自身存在的反馈抑制对维持细胞正常活性具有重要意义。本文初步探索了肿瘤发生过程中L1的作用机制及其遗传学基础,期望为新型肿瘤靶向药物的开发提供新的靶点。