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目的 溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)又称非特异性溃疡性结肠炎,是一种病因不明的直肠和结肠炎性疾病。病变主要累及大肠粘膜与粘膜下层。临床表现为腹泻、粘液脓血便、腹痛。病情轻重不等,多呈反复发作慢性病程。 对于UC病因和发病机制的研究,目前尚未明确。大多数学者认为可能与感染、免疫异常、遗传及精神等多种因素有关,多种促发因素作用于易感者,从而激发肠粘膜亢进的免疫炎症反应。近年研究表明细胞因子、粘附分子、核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)及其他炎性递质表达异常与UC发病关系密切。NF-κB是在进化学上高度保守的一种转录因子,广泛存在于各种组织中,能与许多细胞基因的启动子和增强子中的κB转录序列位发生特异性结合,在免疫和炎症反应、细胞生长、病毒感染及某些疾病急性期反应等方面起着重要作用。NF-κB在肠道炎症过程中的中心调控作用,使其逐渐成为引人注目的新的炎症性肠病治疗靶点。已证明,许多UC临床治疗用药如糖皮质激素、柳氮磺胺吡啶的药理作用均与抑制NF-κB活性有关。糖皮质激素对NF-κB的抑制正是其发挥广泛抗炎作用的基础。同时在临床治疗中发现相当一部分患者对激山东大学硕士学位论文素抵抗,效果欠佳,其机理不清。目前有关NF一KB在溃疡性结肠炎发病机制及激素抵抗中的意义研究尚未见系统研究报道。我们进行了本研究,通过观察溃疡性结肠炎结肠粘膜组织中NF一KB表达水平及其与病情轻重、内镜分级、病理改变、病变部位之间的关系,并观察NF一KB表达水平在溃疡性结肠炎激素敏感组、激素抵抗组中行激素治疗前后的变化,探讨NF一KB在溃疡性结肠炎发病中及在激素抵抗中的意义,进一步阐明溃疡性结肠炎的发病机制,为临床治疗开辟新的途径。方法第一部分NF一妞在溃疡性结肠炎发病机制中的意义研究1.病例选择:自2002年10月至2004年8月选择我院门诊及住院溃疡性结肠炎患者34例,其中男性患者20例,女性患者14例,年龄17一70岁(平均41.2岁),均为活动期患者,作为实验组,检测结肠病变粘膜组织中的NF一KB表达水平。设立正常对照组26例。2.主要试剂:鼠抗人哪一KBp65单克隆抗体购自Santa Cruz biotechnology公司,sP试剂盒,DAB显色剂,EDTA抗原修复液(lmmol/l,PHS.0)购自北京中山生物技术公司。3.免疫组织化学S一P二步法步骤:标本制备;组织切片(4林m)常规脱蜡、水化,30ml八HZO:浸泡,37oC 15min;置ED飞’A抗原修复液中,95oC 10min,自然冷却至室温,PBS冲洗;滴加NF一KBp65单克隆抗体(l:250),4℃过夜,37oC复温60min,PBS冲洗;加生物素标记的二抗,37oC 12min,PBS冲洗,DAB显色;冲洗,苏木素复染,封片;结果判断。4.统计学处理:所有数据录入微机,应用SPSS10.0统计软件,将UC组病山东大学硕士学位论文例与正常对照组的阳性细胞染色积分所得数据建立数据库,进行t检验、秩和检验。所有分析显著性水平a=0.05。第二部分NF一忍在溃疡性结肠炎激素抵抗中的意义研究病例选择:自2002年10月至2004年8月选择我院门诊及住院的溃疡性结肠炎患者35例,其中男18例,女17例,年龄20一65岁(平均38.4岁)。所有病例均为活动期中度以上患者,均需应用糖皮质激素治疗,给予强地松治疗,每日剂量20一4omg,疗程4周。根据激素治疗反应分为两个组:病情缓解者为激素敏感组(glueoeortieoid sensitive,CS)(n=20)和病情不缓解者为激素耐药组(glucoeortieoid resistant,CR)(n一15),均作为实验组,检测激素治疗前、治疗后结肠病变粘膜组织中的NF一KB表达水平。同时设立正常对照组16例,检测正常结肠粘膜组织中的NF一KB表达水平。2.主要试剂:鼠抗人NF一KBp65单克隆抗体购自Santa Cruz biotechnology公司,sP试剂盒,DAB显色剂,EDTA抗原修复液(1 mmol/l,PHS.0)购自北京中山生物技术公司。3.免疫组织化学S一P二步法步骤:标本制备;组织切片(4林m)常规脱蜡、水化,30ml八HZO:浸泡,37oC 15min;置EDI’A抗原修复液中,95oC 10min,自然冷却至室温,PBs冲洗;滴加NF一KBp65单克隆抗体(1:250),4℃过夜,37oC复温60min,PBS冲洗;加生物素标记的二抗,37oC 12min,PBS冲洗,DAB显色;冲洗,苏木素复染,封片:结果判断。4.统计学处理:所有数据录入微机,应用SPSS10.O统计软件,将UC组病例与正常对照组的阳性细胞染色积分所得数据建立数据库,进行t检验、秩和 检验。所有分析显著性水平a=0.05。山东大学硕士学位论文结果第一部分NF一出在溃疡性结肠炎发病机制中的意义研究 1.NF一KBP65表达于uc患者结肠粘膜组织的表面上皮细胞、隐窝上皮细胞、血管内皮细胞等,及单核细胞及巨噬细胞内,呈弥漫或颗粒性分布,多呈深棕黄色或褐色、粗颗粒状分布。在水肿区和临近溃疡区的表面上皮、隐窝脓肿、隐窝上皮及上皮增生处表达明显增强。2.大多数NF一妞的阳性染色都表现在核内,而仅有少量的NF一沼阳性细胞表现为胞质着色。3.在正常组织N’F一KBp65无或仅有弱阳性表达,溃疡性结肠炎组与正常对照组表达水平的比较(5.2土2.7vsl.o士0.9),差异有显著性(P<0.01)。4.NF一KBp65的表达强度与病情活动性(病情轻重、内镜分级、组织学分级、病变部位)之间有一