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体外培养的动物细胞在生物学研究、细胞治疗、转基因及动物克隆等领域均有非常重要的应用价值。但是,从动物组织分离的原代细胞增殖寿命有限,不利于体外连续传代培养,从而也不利于它们在基因打靶、转基因克隆等领域的应用。研究证明,在正常体细胞中异位表达人端粒酶逆转录酶基因(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)可以重构端粒酶活性,延长细胞寿命。然而,组成型表达hTERT会导致克隆胚胎发育停滞等问题。因此,本文试图通过条件性表达hTERT,建立可逆永生化绵羊成纤维细胞系,用于今后家畜体细胞转基因克隆及其它生物学研究。基于Tet-on系统,构建了hTERT可诱导表达质粒载体pTet-onhTEKT。利用电击转染的方法,将线性化的pTet-on hTERT转染到绵羊胎儿成纤维细胞中。在Dox (doxycyline)的诱导下,最终获得了6个稳定表达hTERT的细胞克隆。6个细胞克隆从96孔板扩增到60mm时,各分成两组：一组培养液中持续添加Dox,记为h(+)组；一组培养液中撤销Dox,记为h(-)组。用RT-PCR和Western blot分别检测了两组细胞中hTERT mRNA和hTERT蛋白质的表达水平,检测结果显示h(+)细胞中高表达hTERT mRNA和hTERT蛋白质。用TRPA (telomeric repeat amplification protocol)法检测了两组细胞中的端粒酶活性,结果证明在h(+)细胞中能够重构端粒酶活性。经过120天的连续传代培养,h(-)组细胞种群增长速率逐渐变慢直至衰老死亡,而h(+)组细胞种群增长速率一直保持稳定且细胞状态良好。这些结果证明了,异位表达hTERT能够使绵羊胎儿成纤维细胞永生化。随后,将h(+)组细胞又分成两组：一组培养液中仍添加Dox,仍记为h(+)组：另一组培养液中撤销Dox,记为h(+-)组。又经过130天的连续传代培养,h(+)组细胞种群增长速率仍保持不变且细胞状态良好,而h(+-)组细胞种群增长速率逐渐变慢且细胞形态扁平,证明了撤销Dox能够使永生化细胞发生逆转。对连续传代培养共250天左右的h(+)组细胞进行软琼脂克隆形成实验和染色体核型分析,结果证明永生化细胞未发生恶性转化。除此之外,将肌分化因子MyoD转染连续传代培养200天的h2(+)细胞。经过又一轮的细胞克隆筛选后,得到13个整合了MyoD的细胞克隆。通过RT-PCR,检测了这13个克隆中MyoD及其它肌肉特异性基因的表达。这一实验表明,寿命延长的h(+)细胞可以进行再一轮的转基因操作,因此可用于基因修饰和基础细胞学研究等。成年成纤维细胞较胎儿成纤维细胞取材更方便且不涉及伦理问题,更重要的是成年成纤维细胞作为核供体可以用于优良性状动物个体的克隆以及珍稀和濒危动物的扩繁及保种。但是,与胎儿成纤维细胞相比,成年成纤维细胞的增殖能力更差,核移植效率也更低。为了解决这一问题,本文又将pTet-on hTERT转染成年绵羊成纤维细胞,筛选得到了寿命延长的细胞克隆A3h38(+)。用连续传代培养136天的A3h38(+)细胞与原代成年成纤维细胞分别进行细胞集落形成实验,结果表明,A3h38(+)细胞的单细胞集落形成能力及集落扩增能力都显著高于原代成年绵羊成纤维细胞。然后,用连续传代培养80天的A3h38(+)细胞与原代成年成纤维细胞分别作为核供体进行核移植,结果显示A3h38(+)细胞作为核供体的克隆胚胎囊胚率比原代成年成纤维细胞显著提高。因此,建立永生化成纤维细胞系将为家畜体细胞的基因修饰及转基因克隆提供宝贵材料。