疼痛是一把双刃剑，作为一种防御机制，它能使机体对外界伤害性刺激做出迅速反应，是机体维持生存的必要条件，但是长期持续的慢性疼痛，即为神经系统在病理状态下一种有害反应。疼痛按其机制可分为炎性疼痛，神经病理性疼痛，癌性疼痛。癌性疼痛是指由癌症、癌症相关性病变及抗癌治疗所致的疼痛，常为慢性疼痛，是癌症患者的常见症状。据WHO统计全世界每年有1000万新发癌症患者，600万人死于癌症，其中50％的患者有癌性疼痛症状，75%的晚期癌症患者以疼痛为主要症状,而骨癌痛则是难治性癌痛最为常见的一种。　　溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid，LPA)是一类具有生物活性的结构简单的甘油磷脂类物质，它普遍存在于所有真核生物的各种组织内，具有广泛的生物学功能，包括细胞增殖、迁移、伤口愈合、细胞粘连以及调节细胞因子的释放等。目前发现LPA有六类受体，LPA1-6，它们均为G蛋白偶联受体，在外周感觉传入初级神经元背根神经节(dorsal root ganglion，DRG)细胞上主要表达LPA1受体。近年来的许多报道表明，LPA1参与神经病理痛的产生。然而，尚不清楚LPA1是否也参与癌症痛的产生。　　在髓鞘形成的过程中，LPA1在少突胶质细胞中有大量表达，在即将出生时表达下调，出生后主要在大脑周围的少突胶质细胞和外周神经纤维如坐骨神经周围的成髓鞘胶质细胞如:施旺细胞中表达。LPA1在神经系统中丰富的表达提示了LPA1在神经系统中的重要性。体外的实验表明LPA通过其受体LPA1的激活在培养的施旺细胞的生长过程中发挥着至关重要的作用。　　LPA1与三种G蛋白相偶联：Gαi/o，Gαq/11,和Gα12/13。LPA1的激活通过和这三类G蛋白偶联而诱发许多细胞反应如:细胞增殖和存活、细胞迁移以及细胞骨架的改变;通过血清反应元件的激活改变细胞间的相互作用、钙离子的活动以及腺苷酸环化酶的抑制。　　P2X嘌呤受体为ATP的受体，是配体门控阳离子通道，其中P2X3亚单位高度选择性表达于小直径的感觉神经元，而背根神经节(dorsal root ganglion，DRG)中的这种小直径的神经元多数是与痛觉传递密切相关的含C纤维或Aδ纤维的感觉神经元，目前，越来越多的证据表明P2X3在疼痛发生发展中起着重要作用。在脊髓，P2X3免疫反应性从DRG神经元轴突末梢进入背角内Ⅱ层,从Ⅱ层标记神经的形态学特点来看，P2X3受体大部分位于具有感觉神经末梢超微结构特征的神经末端。从DRG神经元的外周末梢来看,大、小鼠皮肤的神经纤维存在P2X3免疫反应性,这些纤维向表面延伸,终止于表皮。　　本研究小组前期发现骨癌痛大鼠背根神经节中存在P2X3受体的功能性上调，提示P2X3受体参与了骨癌痛的形成机制，但何种原因致使骨癌痛大鼠产生此种改变，P2X3受体介导的骨癌痛机制又受何种物质的进一步调控尚未完全明了，本研究所用的Walker256细胞可致使模型大鼠体内产生大量的溶血磷脂酸，同时有报道称LPA1在骨癌痛模型的出现表达上调，因此研究溶血磷脂酸及其受体对P2X3介导的骨癌痛机制有何调控作用，有利于深入揭示骨癌痛的形成机制，为治疗骨癌痛提供新的治疗策略。　　我们在大鼠胫骨骨髓腔内接种 Walker256乳腺癌细胞的骨癌痛模型上，应用X光检测、免疫荧光组织化学以及行为学实验技术，研究了骨癌动物影像学和行为学的变化、LPA1对P2X3受体的调制及其可能的信号通路。主要结果如下:　　1.骨癌痛模型:行为学和影像学变化　　1.1.大鼠骨癌痛模型的建立及行为学表现　　大鼠胫骨骨髓腔内接种Walker256乳腺癌细胞后，出现了类似临床的病理特征如机械痛敏、骨质损伤和体重下降等系列的行为和形态学的变化。在肿瘤接种后的第17天，X光检查发现骨癌大鼠术侧胫骨发生了严重的骨质损伤，骨内局部结构缺失，边缘模糊，骨内密度不均匀，关节边缘的骨质被明显地侵蚀和破坏。在此阶段，骨癌动物状态较差，体形瘦弱，摄食减少，反应迟钝，毛色暗沉，患侧腿很少负重，轻触即可引起疼痛。接种21天以后骨癌大鼠状态逐渐变差，并开始陆续死亡。　　利用 von Frey测试对骨癌痛的发展时程进行了检测。和假手术动物相比，模型大鼠在肿瘤植入后第4天出现痛觉过敏，但无影像学改变，推测这可能与肿瘤细胞植入骨髓腔后早期机体免疫或炎症等反应有关。在接种后的10天，其机械痛阈值（mechanical threshold)有明显的降低，即出现了机械触诱发痛，之后其机械痛阈值持续降低，接种后第16天降到最低。17至20天机械痛阈值相对值稳定。21天之后可能由于骨癌的发展导致骨癌大鼠行动能力受到影响而使机械痛值失准，其患肢出现持续自发抬腿现象，即自发痛（Spontaneous pain），故而术后17-20天为研究窗口期。　　1.2.大鼠骨癌痛模型的影像学表现　　为了验证骨癌模型的成功建立，对骨癌模型大鼠接种肿瘤的部位即胫骨进行了X光检测。对肿瘤接种后第17天的骨癌动物及假手术动物的术侧胫骨进行X光检测，观察它的骨质损伤情况。结果发现骨癌动物在接种后的第17天出现了明显的骨质损伤。在接种肿瘤后的第17天，假手术动物的术侧胫骨骨质均匀一致，结构完整，其边缘清晰锐利，而骨癌动物术侧胫骨则出现局部结构缺失，边缘模糊，骨内密度不均匀，关节边缘的骨质被明显地侵蚀和破坏。X光片显示的骨质损伤现象提示骨癌动物模型的成功建立。　　2. P2X3对骨癌大鼠外周伤害性感受器的作用　　2.1.P2X3受体表达的上调　　P2X3受体免疫反应主要存在于一些中、小直径神经元，而大直径的神经元缺乏P2X3受体免疫反应，为了研究P2X3在骨癌痛中可能发挥的作用，检测了接种后第17天骨癌动物术侧 DRGL4-5节段中P2X3受体表达的变化。免疫荧光染色结果表明，与对照侧相比骨癌痛组手术侧P2X3表达明显增高，提示P2X3可能参与了骨癌痛的产生。因此，进一步利用P2X3激动剂α,β-meATP及其拮抗剂A317491研究了P2X3的激活在骨癌痛中的作用。　　2.2. P2X3受体激动剂对骨癌大鼠痛敏的易化　　在接种后第17天，通过足底注射给药方式分别对骨癌组和假手术组手术侧足底给予同体积20nM、50nMα,β-meATP，通过记录大鼠注射药物后30min内每分钟的抬脚次数和悬空时间，计算出综合悬空时间，对手术组与假手术组进行比较分析，以此衡量在骨癌痛模型大鼠中α,β-meATP对骨癌大鼠自发性疼痛行为的易化作用，结果表明，表明P2X3的激活参与了骨癌痛的产生。　　2.2.P2X3受体拮抗剂对骨癌痛的抑制　　在接种后第17天，通过鞘内置管的方式对骨癌动物鞘内给予A317491或生理盐水，作为给药组和对照组，分别于注射前30min、0min和注射后15、30、60、90、120min测机械痛阈值，2小时后在大鼠足底注射α,β-meATP，通过记录大鼠注射药物后30min内每分钟的抬脚次数和悬空时间，计算出综合悬空时间,与对照组进行比较分析，结果表明，和对骨癌动物给予生理盐水相比，鞘内给予A317491可以抑制P2X3介导的痛敏行为。　　3.LPA1对骨癌大鼠外周伤害性感受器的作用　　3.1.LPA1受体与P2X3受体在DRG神经元上共表达　　利用组织化学染色检测了LPA1受体与P2X3受体在DRG神经元上共表达，结果显示，LPA1受体与P2X3受体在DRG神经元上存在大量的共表达，这为它们之间可能的相互作用提供了形态学基础。　　3.2 LPA1受体表达的上调及其拮抗剂对骨癌痛的抑制　　为了研究LPA1在骨癌痛中可能发挥的作用，检测了接种后第17天骨癌动物术侧DRGL4-5节段中LPA1受体表达的变化。免疫组织化学染色结果表明，和假手术动物相比，接种后第14天骨癌动物术侧 DRGL4-5中LPA1受体表达明显增多，提示LPA1可能参与了骨癌痛的产生。因此，进一步利用LPA1拮抗剂VPC32183研究了LPA1在骨癌痛中的作用。　　在接种后第17天，通过鞘内置管的方式对骨癌动物鞘内给予VPC32183或生理盐水，作为给药组和对照组，于注射前30min、0min和注射后15、30、60、90、120、240、360、480min测机械痛阈值，与对照组进行比较分析，结果表明，和对骨癌动物给予生理盐水相比，鞘内给予VPC32183药物30min后可以较大程度抑制骨癌大鼠触诱发痛行为。表明LPA1也参与了骨癌痛的产生。　　3.3.LPA1受体拮抗剂对P2X3受体介导的骨癌大鼠痛敏的抑制　　进一步利用LPA1拮抗剂VPC32183研究其在P2X3受体介导的骨癌痛中的作用。在接种后第17天，通过鞘内置管的方式对骨癌动物鞘内给予2mMVPC32183或生理盐水，作为给药组和对照组，于鞘内给药30min后在大鼠足底注射α,β-meATP，通过记录大鼠足底注射药物后30min内每分钟的抬脚次数和悬空时间，计算出综合悬空时间，与对照组进行比较分析，结果表明，和对骨癌动物给予生理盐水相比，鞘内给予VPC32183可以抑制α,β-meATP对骨癌大鼠自发痛行为的易化作用。这种现象在假手术动物中并没有发现，表明在骨癌状态下LPA1受体拮抗剂可以抑制P2X3介导的痛敏行为。　　3.4.LPA1对P2X3调制的信号通路分析　　为进一步探讨LPA1调制P2X3可能的信号通路。在足底注射α,β-meATP之前，将接种第17天的大鼠分别鞘内给予小G蛋白Rho抑制剂BoTXC3、ROCK信号通路阻断剂Y27632以及PLC阻断剂 U73122，结果发现U73122、BoTXC3以及Y27632均可以不同程度抑制P2X3受体激动剂对骨癌大鼠痛敏的易化。该行为学结果表明，在骨癌大鼠中α,β-meATP对P2X3受体的易化作用可能通过LPA1受体来完成的，并依赖于其下游Rho-Rock信号通路，以及PLC信号通路。　　结论:(l)骨癌引起大鼠外周神经持续性疼痛;(2)骨癌明显上调伤害性感受器DRG中LPA1受体和P2X3受体的表达，两者的拮抗剂均可缓解骨癌痛;(3)LPA1受体的拮抗剂能有效阻断P2X3受体介导的骨癌大鼠的痛敏行为，这种作用可能是LPA1参与骨癌痛的外周机制之一;(4)LPA1对P2X3受体的调制作用可能依赖于Rho-ROCK信号通路及PLC信号通路。