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牛结核病(Bovine tuberculosis)主要是由牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)引起的一种人兽共患传染病,该病的流行与传播不仅严重地影响着畜牧业的持续发展,而且也严重地威胁和危害着人类的生命与健康,被国际兽疫局(OIE)列为B类传染病。人结核病的10%以上是由牛分枝杆菌引起的。近年来,人结核病在世界范围内大幅回升,每年死亡人数高达300万,是其它传染病死亡人数之和,当属传染病之魁首。由于牛结核病的存在,致使人结核病最终无法根除。近年来,牛结核病在全球范围内也呈上升趋势,尤其是在广大的发展中国家流行严重,我国牛结核的阳性检出率为10%左右。在牛结核病的预防上,目前唯一可用的疫苗就是卡介苗(BCG),但是接种BCG后免疫效果不确定,同时还干扰牛PPD的变态反应检测,无法区别是自然感染还是人工免疫,给日常检疫工作带来了相当的困难。因此研发牛结核病的新型诊断和预防制剂已成为控制牛结核病的研究热点。 结核分枝杆菌是细胞内寄生菌,机体抵抗结核分枝杆菌的感染主要依靠细胞免疫。研究发现,结核分枝杆菌培养滤液中存在的大量分泌蛋白能有效地诱发对结核分枝杆菌的抵抗性,产生免疫保护作用,因此分泌蛋白是保护性抗原。DNA疫苗能有效地刺激机体产生持久的体液免疫和细胞免疫应答,而且DNA疫苗在细胞内表达的蛋白抗原通过MHC I类分子呈递抗原,激活CTL及杀灭靶细胞是DNA疫苗发挥保护作用的最主要机制之一,这正是抗结核感染所必需的。另有研究指出,DNA疫苗免疫后,不干扰结核病的变态反应检测。为了研制牛结核病敏感、特异的诊断试剂和新型、高效的预防制剂,尤其是DNA疫苗,本研究进行了以下几方面的工作: 1、牛分枝杆菌主要保护性抗原基因的克隆筛选了M. bovis Ag85A、Ag85B、MPB51、MPB63、MPB70、MPB83和ESAT-6七种分泌蛋白的保护性抗原基因。以M. bovis Vallee111染色体DNA为模板,以Ag85A、Ag85B、MPB51、MPB63、MPB70、MPB83和ESAT-6成熟蛋白基因特异性引物进行PCR扩增,分别扩增出888bp、858bp、801bp、390bp、492bp、603bp和288bp的DNA片段。通过T-A克隆技术,将PCR产物克隆至pGEM-T Vector中,以α-互补法、质粒大小鉴定、酶切鉴定、PCR鉴定及序列分析鉴定重组克隆,成功地构建出克隆质粒pGEM-T-85A、pGEM-T-85B、pGEM-T-51、pGEM-T-63、pGEM-T-70、pGEM-T-83、pGEM-T-ESAT-6。序列测定及同源性分析表明,所获得的M. boris Vallee111成熟蛋白基因与M. bovis中其它菌株相应基因具有高度的同源性。 2、主要保护性抗原基因的原核表达 为了获得M. bovis七个保护性抗原基因的表达产